РАЗМАЗИВАЊЕ БАКТЕРИЈА: КАРАКТЕРИСТИКЕ И ПРИПРЕМА - БИОЛОГИЈА - 2025

Бактеријска размаз је танак слој мрља суспензије бактеријских микроорганизама који је направљен на транспарентном стаклене плоче или слајд, за посматрање под микроскопом лигхт.

Продужетак у облику филма врши се тако да се микроорганизми раздвоје што је више могуће, јер ако су они груписани, опажање није јасно.

Слика 1. Бактеријски брис уочен под скенирајућим електронским микроскопом. Извор: пикбаи.цом

У студији бактеријских култура користе се технике припреме, фиксације и бојења како би се боље анализирале. Због мале величине микроорганизама, за њихово посматрање је неопходна употреба оптичког микроскопа.

Оптички микроскопи су основни инструменти за посматрање бриса. Оне користе оптичка сочива и светлост која омогућава гледање узорака са великим увећањем.

Уопште, живе ћелије немају углавном обојене структуре, гледано светлосним микроскопом то су безбојни, прозирни узорци, а показују врло мало унутрашњег контраста и са њиховим окружењем.

Посматрање једноставним оптичким микроскопом са светлим пољем, без употребе помоћних техника бојења, је врло ограничено и употребљава се само у неким случајевима, као што је посматрање кретања микроорганизама.

За оптимално посматрање микроорганизама, мора се успоставити равнотежа између контраста и разлучивости. Детаљи ћелије се не могу видети под микроскопом, чак ни са великом резолуцијом; Употреба боја је потребна техникама бојења, које дају контраст за посматрање.

Карактеристике доброг квалитета бактеријског бриса

Одличан контраст

Да би се постигао одличан контраст постоје софистицирани микроскопи који се називају фазни контрастни микроскопи, диференцијални интерференцијски микроскопи и микроскопи са тамним пољем. Ова врста микроскопа се користи, између осталог, за посматрање бактеријских структура попут омотача и нити.

Бојење је једноставна техника повећања контраста која се постиже светлосним микроскопом. У овој се техници могу користити различите мрље, које значајно побољшавају микроскопско посматрање.

Мрље се наносе директно на брисе или наставке суспензија микроорганизама на тобоганима, претходно осушеним и фиксираним.

Гоод фик

Фиксација је техника која се користи за очување ћелијских структура; изазива инактивацију микроорганизама и пријањање за стакло клизача. Постоје различити третмани за фиксирање: фиксација топлоте и хемијска фиксација.

Фиксација топлоте

Ово је најчешће коришћена метода за посматрање бриса бактерија. Техника се састоји од пропуштања бактеријске суспензије бриса кроз пламен упаљача. Ова техника је у стању да сачува спољну морфологију бактерија, али уништава њихове унутрашње структуре.

Хемијска фиксација

У хемијској фиксацији се између осталог користе и хемикалије за очување, као што су формалдехид или формалин, етанол и сирћетна киселина. Предност употребе хемијских средстава за учвршћивање је у томе што се постиже очување унутрашњих ћелијских структура микроорганизама.

Слика 2. Крв из крви. Извор: Бобјгалиндо, из Викимедиа Цоммонс

Добра боја

Најчешћи поступци бојења претходно осушеног и фиксираног мрља су позитивно или једноставно бојење, диференцијално бојање и негативно бојење. Постоје и посебне технике бојења одређених ћелијских структура (капсула, споре, флагеле).

Позитивно бојење или једноставно бојење

Позитивно или једноставно бојење је најчешће коришћена техника бојења размаза. Користи боје које имају способност везања на одређене микробне структуре, омогућавајући им посматрање под микроскопом.

Ове боје имају хромофорне групе (обојени део) у својој хемијској структури, са наизменичним двоструким везама и једноструким везама (коњугација). Ове везе заузврат могу успоставити јонске или ковалентне везе са неким ћелијским структурама.

Боје које се користе у позитивним или једноставним бојењу су углавном хемијски деривати анилина (обојене органске соли).

Са друге стране, међу бојама можемо пронаћи неке са базним пХ, а друге са киселим пХ.

Основна бојила

У основним бојама, хромофорна група има позитиван електрични набој. Огромна већина прокариотских микроорганизама има неутралан унутрашњи пХ, а њихова ћелијска површина је негативно набијена. Кроз ову електростатску интеракцију хромофор се веже за ћелију и обојава је.

Примери основних боја су метилен плава, кристално љубичаста, малахит зелена, основни фусцин, сафранин, између осталих.

Киселе боје

Код киселих боја, хромофорна група има негативан електрични набој. Користе се за бојење протеина са позитивно наелектрисаним амино групама. Примери киселих боја су кисели фусцин, ружа Бенгал, црвени конго и еозин.

Диференцијално бојење

Техника диференцијалног бојења састоји се у наношењу две боје различите боје или интензитета, ради разликовања различитих микроорганизама под микроскопом. Боја по Граму и мрља отпорност на киселину и алкохол најчешће су различите бактерије у бактериологији.

Мрља по Граму користи се као прелиминарни тест за познавање облика, величине, групирања ћелија, као и врсте ћелијског зида. Користећи се тестом мрља по Граму, бактерије ћелијских зидова се класификују у грам-позитивне бактерије и грам-негативне бактерије.

Негативно бојење

У овој се техници користе хемијска бојила која не продиру у унутрашњост ћелије, али чине медијум у којем се микроорганизми појављују као црна позадина.

У техници негативног бојења, мрља се прави капљицом суспензије мастила Индије или нигросина, која након омогућавања сушења на собној температури формира непрозиран филм за пролазак светлости. На овај начин се микроорганизми појављују као сјајни облици на тамној позадини.

Припрема

А. Смеар

1.- Клизаче добро оперите, осушите упијајућим папиром и налепите их. Етикета мора да садржи садржај препарата, датум и име особе која га је обрадила.

2. - Упалите упаљач и стерилизирајте петљу за инокулацију у пламену до јарко црвене боје.

3.- Оставите да се дршка охлади.

4.- Узмите епрувету за бактеријску културу, уклоните поклопац и брзо прођите усана епрувете у близини пламена горионика (пламен).

5.- Убаците петљу за инокулацију у епрувету која садржи бактеријску културу и узмите узорак.

6.- Ако је култура у течном медијуму, узорак узет ручком ставите у средину тобогана и пажљиво га размажите у круг пречника отприлике 2 цм.

7.- Поновно стерилизирајте петљу за инокулацију.

8.- Оставите да се суз на ваздуху осуши.

9.- Поновите кораке 3 до 8 три пута.

10.- Ако је култура у чврстом медијуму, на тобоган се претходно мора ставити кап дестиловане воде. Ово се ради да би се помешао мали узорак културе узет са инокулационом петљом, као што је речено у корацима 2 до 5 (асептични услови).

11.- Разблажите разблажени узорак капљицом воде на слајд и поновите три пута.

Б. Фиксација

1.- Додајте две капи метанола или апсолутног етанола сувим мрљама - из култура у течном медијуму -.

2. - Омогућите сушење ваздуха даље од упаљача.

3. - Ако се мрља добије из културе у чврстом медијуму, суви се мирис фиксира топлином, пропуштајући га 2 до 3 пута брзо кроз најтоплији део упаљача.

4.- Додирните доњи део мрље доњим делом леве руке (за десничаре; у супротном користите десну руку) и проверите да ли је хладно.

Ц. Једноставно бојење

1.- У мрљу додајте 2 капи одабране мрље и оставите да делује током времена које је потребно у посебним протоколима за сваку мрљу (углавном између 1 и 5 минута).

2.- Неким мрљама је потребна употреба топлоте за њихово активирање; у том случају морате бити веома опрезни приликом загревања клизача на упаљачу (манипулирајте пинцетом и избегавајте кључање). Прегрејањем бриса могу се уништити ћелије које треба посматрати.

3.- Уклоните вишак бојила испирањем дестилованом водом из пикета. Уклоните воду за прање лаганим додиривањем клизача по њеној ивици, нагнутог на радном столу.

4.- Омогућити сушење ваздуха.

5.- Зависно од врсте посматрања, у овој фази се користи поклопац или не. Покривач штити и чува размаз. Ако се у овој фази врши проматрање урањања уља, не користе се покровни поклопци, али мрља се не може сачувати.

Д. Дефинитивно очување размаза

1. - Умазати сукцесију узастопце у свакој од ниже наведених отопина, у трајању од најмање 5 минута. Сврха ових "купки" је да потпуно дехидрирају размаз. Сваки реагенс треба темељно исушити пре него што се убризгава у следећу купку.

Редослед купки за дехидрацију је следећи:

1. Етанол 70%
2. 95% етанол
3. Чисти ацетон
4. Смеша ацетон-циклол 1: 1
5. Ксилол

Затим оставите да се осуши на ваздуху.

2. Монтирајте покривач, најбоље 22 × 22 мм, користећи канадски балзам или други медијум за уградњу.

Референце

1. Бриггс, Г. (1965). Узрочници у микробиолошким лабораторијским незгодама и инфекцијама. Биолошке лабораторије америчке војске. Форт Детрицк.
2. Цаппуцино, ЈГ и Велцх, ЦТ (2017). Микробиологија: Лабораторијски приручник. Пеарсон.
3. Холт, уредник ЈГ-а. (1977). Краћи је Бергеиев приручник о одлучујућој бактериологији. 8 ^-ог Балтимор Тхе Виллиамс & Вилкинс Цо
4. Јохнсон, ТР и Цасе; ЦЛ (2018). Лабораторијски експерименти у микробиологији. Пеарсон.
5. Тилле, П. (2017). Дијагностичка микробиологија. 14 ^тх Ст. Лоуис, УСА: Елсиевер, Инц.