ЦИТОХЕМИЈА: ИСТОРИЈА, ПРЕДМЕТ ПРОУЧАВАЊА, КОРИСНОСТ И ТЕХНИКЕ - БИОЛОГИЈА - 2025

Цитоцхемистри садржи низ техника које се ослањају на идентификацију и распореда појединих супстанци унутар ћелије. Сматра се граном ћелијске биологије која комбинује ћелијску морфологију и хемијску структуру.

Према Бенслеиу, оснивачу примене модерне цитологије, изражава да је сврха цитохемије откривање хемијске организације ћелија како би се разумеле мистерије живота. Као и проучавање динамичких промена које се дешавају током различитих функционалних фаза.

1: Пагетова ванредна болест. (Хематоксилин-Еозин) 2: сенилни плакови примећени у коре мождане коре код пацијента са Алзхеимеровом болешћу. (Сребрна импрегнација) 3: Зечји језик, колагена влакна (плава). Мишићна влакна (љубичасте пруге). (Массон-ов трихром). 4: Ткиво јетре са дегенерацијом масти. (Судан ИИИ) 5: Упала јетре. Некроза. (Толуидин плава) Извори: Википедиа. цом / Корисник: КГХ / Датотеке јавних домена / Мохит Лалвани

На овај начин је могуће утврдити метаболичку улогу коју ове супстанце играју у ћелији.

Цитохемија користи две главне методе. Први се заснива на хемијским и физикалним поступцима. Ове технике прибегавају коришћењу микроскопа као неопходног инструмента за визуелизацију хемијских реакција које се дешавају на одређене супстанце у ћелији.

Пример: употреба цитохемијских боја, попут Феулген-ове или ПАС реакције, између осталих.

Друга метода заснива се на биохемији и микрохемији. Овом методологијом могуће је квантитативно одредити присуство међућелијских хемикалија.

Међу супстанцама које се могу открити у ткиву или ћелијској структури јесу: протеини, нуклеинске киселине, полисахариди и липиди.

Историја цитохемије

Цитохемијске технике од њиховог проналаска помогле су разумевању састава ћелија, а с временом су се појавиле различите технике које користе различите врсте боја са различитим афинитетима и основама.

Након тога, цитохемија је отворила нове хоризонте употребом одређених супстрата како би колориметријски показао присуство ензима или других молекула у ћелији.

Исто тако, појавиле су се и друге технике попут имуноцитохемије која је била од велике помоћи у дијагностици многих болести. Имуноцитохемија се заснива на реакцијама антиген-антитела.

С друге стране, цитохемија је такође користила флуоресцентне материје зване флуорохроми, који су одлични маркери за откривање одређених ћелијских структура. Због карактеристика флуорохрома, он истиче структуре на које је причвршћен.

Шта учиш?

Различите цитохемијске технике коришћене на биолошком узорку имају нешто заједничко: откривају присуство одређене врсте супстанци и знају њихову локацију унутар процењене биолошке структуре, било да је то ћелијски тип или ткиво.

Те супстанце могу бити ензими, тешки метали, липиди, гликоген и дефинисане хемијске групе (алдехиди, тирозин, итд.).

Информације које пружају ове технике могу пружити смернице не само за идентификацију ћелија, већ и за дијагнозу различитих патологија.

На пример, цитохемијске мрље су врло корисне у разликовању различитих врста леукемије, јер неке ћелије изражавају одређене ензиме или кључне супстанце, а друге не.

С друге стране, треба приметити да би, како би се примењивала цитохемија, требало узети у обзир следећа разматрања:

1) Супстанца се мора имобилисати на месту где се природно налази.

2) Супстанца се мора идентификовати помоћу супстрата који конкретно реагују са њом, а не са другим једињењима.

Корисност

Узорци који се могу проучавати помоћу цитохемијских техника су:

- проширена периферна крв.

- Проширена коштана срж.

- ткива фиксирана за хистохемијске технике.

- Ћелије фиксиране цитоцентрифугирањем.

Цитохемијске технике су од велике подршке у области хематологије, јер се широко користе како би се помогло у дијагностици и диференцијацији одређених врста леукемије.

На пример: Естеразне реакције се користе за разликовање мијеломоноцитне леукемије од акутне моноцитне леукемије.

Мрље коштане сржи и периферне крви код ових пацијената су сличне, јер је неке ћелије тешко идентификовати морфолошки саме. Због тога се врши естераза тест.

У првом су специфичне естеразе позитивне, док су у другом неспецифичне.

Такође су веома корисни у хистологији, јер, на пример, коришћење технике бојења тешким металима (импрегнација сребром) мрља ретикуларна влакна интензивне браон боје у ткиву миокарда.

Технике цитохемије

Доље ће бити објашњене најчешће коришћене технике:

- Употреба боја

Мрље које се користе су цитохемијске технике веома разнолике и могу се класификовати у складу са неколико тачака гледишта:

Према радикалу за који имају афинитет

Подељени су у: кисели, базични или неутрални. Они су најједноставнији и најчешће коришћени у историји, омогућавајући нам разликовање базофилних компонената од ацидофилних. Пример: обојење хематоксилином-еозином.

У овом случају језгра ћелија обојају плаво (узимају хематокслин, што је основна мрља), а цитоплазме, црвене (узимају еозин, што је кисела мрља).

Према боји коју пружају

Могу бити ортохроматски или метахроматски. Ортохроматика је она која обојава структуре исте боје као и боје. На пример, случај еозина, чија је боја црвена, а мрље црвена.

Са друге стране, метахроматика обојава структуре другачије боје од њихове, као што је, на пример, толуидин, чија је боја плава, а опет је љубичаста.

Виталне или суправиталне боје

Они су безопасне боје, односно обоје ћелије и остану живе. Те се мрље називају виталним (нпр. Трипан плавим да би се обојили макрофаги) или суправиталним (нпр. Јанус зелено за обојење митохондрија или неутрално црвено за обојење лизосома).

- Откривање липида помоћу боја растворљивих у масти

Осмијум тетроксид

Боје липиде (незасићене масне киселине) црне боје. Ова се реакција може посматрати светлосним микроскопом, али пошто је ова боја високе густине, она се такође може визуелизовати помоћу електронског микроскопа.

Судан ИИИ

Једна је од најкоришћенијих. Ова боја се дифундира и раствара у ткивима, накупљајући се у капљицама липида. Боја је гримизно црвена.

Суданска црна мрља Б

Израђује бољи контраст од претходних, јер се може растворити и у фосфолипидима и холестеролу. Корисно је за откривање азурофилних и специфичних гранула зрелих гранулоцита и њихових прекурсора. Због тога идентификује мијелоидне леукемије.

- бојење алдехидном групом (периодична киселина Сцхифф мрља)

Шифова периодичне киселине, мрља може открити три врсте алдехидних група. Су:

- Слободни алдехиди, природно присутни у ткивима (реакција плазме).

- Алдехиди добијени селективном оксидацијом (ПАС реакција).

- Алдехиди настали селективном хидролизом (Феулген-ова реакција).

ПАС реакција

Бојење се заснива на откривању одређених врста угљених хидрата, као што је гликоген. Периодна киселина Сцхифф прекида ЦЦ везе угљених хидрата услед оксидације гликолних група 1-2, успевајући да ослобађа алдехидне групе.

Слободне алдехидне групе реагују са Сцхифф-овим реагенсом и формирају љубичасто-црвено једињење. Појава љубичасто-црвене боје показује позитивну реакцију.

Овај тест је позитиван у биљним ћелијама, откривајући скроб, целулозу, хемицелулозу и пептине. Док се у животињским ћелијама открива муцине, мукопротеине, хијалуронску киселину и хитин.

Поред тога, користан је у дијагностици лимфобластичне леукемије или еритролеукемије, између осталих патологија мијелодиспластичног типа.

У случају киселих угљених хидрата може се користити алциано плава мрља. Тест је позитиван ако се примети светло плава / тиркизна боја.

Реакција плазме

Реакција у плазми открива присуство одређених алифатичких алдехида дугог ланца као што су палма и стеарал. Ова техника се примењује на замрзнутим хистолошким пресецима. Лечи се директно Сцхифф-овим реагенсом.

Феулгенска реакција

Овом техником се открива присуство ДНК. Техника се састоји од подвргавања фиксираног ткива хидролизи слабе киселине да би се касније омогућило да реагује са Сцхифф-овим реагенсом.

Хидролиза излаже деоксирибоза алдехидне групе на деоксирибоза-пуринској вези. Шифов реагенс тада реагује са алдехидним групама које су остале слободне.

Ова реакција је позитивна у језграма и негативна у цитоплазми ћелија. Позитивност се доказује присуством црвене боје.

Ако се ова техника комбинује са метил-зеленим-пиронином, могуће је истовремено детектовати ДНК и РНК.

- Цитохемијске мрље за протеинске структуре

За то се може користити Миллонова реакција која као живу користи живин нитрат. Структуре које садрже ароматичне аминокиселине ће постати црвено обојене.

- Цитохемијске мрље које користе супстрате да би показале присуство ензима

Ове мрље се заснивају на инкубацији биолошког узорка са специфичним супстратом, а производ реакције након тога реагује са диазо солима да формира обојени комплекс.

Естерасес

Ови ензими су присутни у лизосомима неких крвних ћелија и способни су да хидролизују органске естере ослобађајући нафтон. Последња формира нерастворљиву азо-боју кад се веже на диазо-сол, обојећи место где се реакција дешава.

Постоји неколико супстрата и зависно од тога која се употребљава могу се идентификовати специфичне естеразе и неспецифичне естеразе. Прве су присутне у незрелим ћелијама мијелоидне серије, а друге у ћелијама моноцитног порекла.

Супстрат који се користи за одређивање специфичних естераза је: нафтол-АС-Д хлороацетат. Иако се за одређивање неспецифичних естераза може користити неколико супстрата, као што су нафтолов АС-Д ацетат, алфа нафтил ацетат и алфа нафтил бутират.

У оба случаја ћелије ће бити тамно црвене када је реакција позитивна.

Миелоперокидасе

Овај ензим се налази у азурофилним гранулама гранулоцитних ћелија и моноцита.

Његова детекција користи се за разликовање леукемија мијелоидног порекла од лимфоидних. Ћелије које садрже мијелопероксидазе постају окер жуте.

Фосфатазе

Ови ензими ослобађају фосфорне киселине из различитих супстрата. Они се међусобно разликују према специфичности супстрата, пХ и деловању инхибитора и инактиватора.

Међу најпознатије су фосфомоноестеразе које хидролизују једноставне естере (ПО). Пример: алкална фосфатаза и киселина фосфатаза, као и фосфамидазе које хидролизују везе (ПН). Користе се за диференцијацију лимфопролиферативних синдрома и за дијагнозу длакаве ћелијске леукемије.

- Трихромне боје

Маллари-Азан трихром

Корисни су за разликовање цитоплазме ћелија од влакана везивног ткива. Ћелије обоје црвено, а колагена влакна плаво.

Массон-ов трихром

Ово има исту корисност као и претходна, али у овом случају ћелије су обојене црвено, а колагена влакна зелена.

- Боје које обоје специфичне органеле

Јанус Греен

Селективно мрља митохондрије.

Сол сребра и осмична киселина

Мрља Голгијев апарат.

Толуидин плава

Мрље Ниссијева тела

Сребрне соли и ПАС

Боје ретикуларна влакна и базалну ламину.

Орцеин и фуксин ресорцин

Боје еластична влакна. С првим су обојене смеђом, а с другом дубоко плавим или љубичастим.

- Остале технике које се користе у цитохемији

Употреба флуоресцентних супстанци или флуорохрома

Постоје технике које користе флуоресцентне супстанце за проучавање локације структуре у ћелији. Те се реакције визуелно приказују посебним микроскопом који се зове флуоресценција. Пример: ИФИ техника (индиректна имунофлуоресценција).

Детекција ћелијских компоненти имуноцитохемијом

Ове технике су веома корисне у медицини јер помажу у откривању одређене ћелијске структуре и уједно је квантификују. Ова реакција је заснована на реакцији антиген-антитело. На пример: ЕЛИСА технике (Ензиме Иммуно Ассаи).

препоруке

- Неопходно је користити контролне мрље за процену добре перформансе боја.

- Свеже брисе треба користити за цитохемијско бојење. Ако није могуће, треба их чувати заштићене од светлости и чувати на 4 ° Ц.

- Треба водити рачуна да употријебљени фиксатив не утиче негативно на супстанцу која се истражује. Другим речима, мора се спречити да га могу екстрахирати или инхибирати.

- Морате поштовати време употребе фиксатива, пошто генерално треба трајати само секунде, јер излагање мрља дужег времена фиксативу може оштетити неке ензиме.

Референце

1. "Цитохемија." Википедија, Слободна енциклопедија. 1 сеп 2018, 17:34 УТЦ. 9 јула 2019, 02:53 Доступно на: википедиа.орг
2. Вилларроел П, де Суарез Ц. Методе металне импрегнације за испитивање ретикуларних влакана миокарда: Упоредна студија. РФМ 2002; 25 (2): 224-230. Доступно на: сциело.орг
3. Сантана А, Лемес А, Боланос Б, Парра А, Мартин М, Молеро Т. Цитохемија киселе фосфатазе: методолошка разматрања. Рев Диагн Биол. 200; 50 (2): 89-92. Доступно на: сциело.орг
4. Де Робертис Е, Де Робертис М. (1986). Ћелијска и молекуларна биологија. 11. издање Редакција Атенео. Буенос Ајрес, Аргентина.
5. Класични алати за проучавање ћелијске биологије. ТП 1 (додатни материјал) - Целл Биологи. Доступно на: дббе.фцен.уба.ар