ЕНДОНУЦЛЕАСЕС: ФУНКЦИЈЕ, ВРСТЕ И ПРИМЕРИ - БИОЛОГИЈА - 2025

У ендонуклеазе су ензими који секу фосфодиестарска везе налазе унутар нуклеотида ланца. Места за ограничавање ендонуклеазе веома су разнолика. Неки од ових ензима режу ДНК (деоксирибонуклеинска киселина, наш генетски материјал) скоро свуда, то јест да нису неспецифични.

Супротно томе, постоји још једна група ендонуклеза које су врло специфичне у региону или секвенци коју треба цепати. Ова група ензима позната је као рестрикциони ензими и веома су корисни у молекуларној биологији. У овој групи имамо добро познате ензиме Бам ХИ, Ецо РИ и Алу И.

Ендонуклеасе режу ДНК изнутра.
Извор: пикабаи.цом

Супротно ендонуклеазама, постоји друга врста каталитичких протеина - егзонуклезуле - који су одговорни за разбијање фосфодиестерских веза на крају ланца.

Рестрицтион ендонуцлеасес

Рестриктивни ендонуклеази или рестрикциони ензими су каталитички протеини који су одговорни за цепање фосфодиестерских веза унутар ДНК ланца у врло специфичним секвенцама.

Ови ензими могу се купити од више биотехнолошких компанија и њихова употреба је готово неопходна у оквиру тренутних техника манипулације ДНК.

Рестриктивним ендонуклеазама називају се првим словима биномног научног имена организма из ког су дошли, а потом слиједи сој (ово није обавезно), а завршава се групом рестрикцијских ензима којима припадају. На пример, Бам ХИ и Ецо РИ се широко користе ендонуклеазе.

Подручје ДНК које ензим препознаје назива се место рестрикције и јединствено је за сваку ендонуклеазу, мада се неколико ензима може подударати на местима рестрикције. Ова локација се обично састоји од кратке палиндромске секвенце у дужини од око 4 до 6 базних парова, као што су АГЦТ (за Алу И) и ГААТТЦ за Ецо РИ.

Палиндромске секвенце су низови који су, иако се читају у правцу 5 'до 3' или 3 'до 5', идентични. На пример, у случају Ецо РИ, палиндромна секвенца је: ГААТТЦ и ЦТТААГ.

Функције и примјене рестрикцијских ендонкула

Срећом за молекуларне биологе, бактерије су током еволуције развиле низ рестрикцијских ендонуклеаза које интерно фрагментирају генетски материјал.

У природи су се ови ензими развили - претпоставља се - као систем бактеријске заштите од инвазије страних молекула ДНК, попут оних из фага.

Да би се разликовала нативни и страни генетски материјал, ове рестрикцијске ендонуклезе могу препознати специфичне нуклеотидне секвенце. Дакле, ДНК која нема тај низ не може се ометати унутар бактерија.

Супротно томе, када ендонуклеаза препозна место рестрикције, веже се за ДНК и пресече је.

Биолози су заинтересовани за проучавање генетског материјала живих бића. Међутим, ДНК се састоји од неколико милиона парова база у дужину. Ови молекули су изузетно дуги и морају се анализирати у малим фрагментима.

Да би се постигао овај циљ, рестрикцијске ендонуклезе су интегрисане у различите протоколе молекуларне биологије. На пример, појединачни ген може бити заробљен и реплициран за будуће анализе. Овај процес се назива "клонирање" гена.

Полиморфизам дужине фрагментације (РФЛП)

Полиморфизми дужине рестриктивног фрагмента односе се на образац специфичних нуклеотидних секвенци у ДНК које рестрикцијске ендонуклезе могу препознати и пресећи.

Захваљујући специфичности ензима, сваки организам карактерише специфичан образац сечења у ДНК, пореклом фрагменти променљиве дужине.

Врсте рестрикцијских ендонуклеаза

Историјски, рестрикцијски ендонуклези су класификовани у три врсте ензима, означене римским бројевима. Недавно је описана четврта врста ендонуклеазе.

Тип И

Најважнија карактеристика ендонуклеазе типа И је да су то протеини састављени од више подјединица. Свака од ових функција функционише као комплекс једног протеина и обично има две подјединице зване Р, две М и једну С.

С део је одговоран за препознавање места рестрикције у ДНК. Подјединица Р је, са своје стране, кључна за цепање и М је одговоран за катализацију реакције метилације.

Постоје четири поткатегорије ензима типа И, познати по словима А, Б, Ц и Д, који су у заједничкој употреби. Ова класификација се заснива на генетској комплементацији.

Ензими типа И били су прва рестрикцијска ендонуклеаза која је откривена и пречишћена. Међутим, у молекуларној биологији најкорисније су врсте ИИ, које ће бити описане у следећем одељку.

Тип ИИ

Ендонуклеаза типа ИИ препознаје специфичне секвенце ДНК и цепи се на константном положају близу секвенце која ствара 5 'фосфата и 3' хидроксила. Они углавном захтевају магнезијумове јоне (Мг ²⁺ ) као кофакторе , али постоје неки који имају много конкретније захтеве.

Структурно се могу појавити као мономери, димери или чак тетрамери. Рекомбинантна технологија користи ендонуклеазе типа ИИ и из тог разлога је окарактерисано више од 3.500 ензима.

Тип ИИИ

Ови ензимски системи су састављени од два гена, названих мод и рес, који кодирају за подјединице које препознају ДНК и за модификације или ограничења. Обе подјединице су неопходне за ограничење, процес потпуно зависан од хидролизе АТП-а.

Да би се цепао молекул ДНК, ензим мора да ступа у интеракцију са две копије не-палиндромске секвенце препознавања и места морају да буду обрнуте оријентације на супстрату. Цепању претходи транслокација ДНК.

Тип ИВ

У последње време је идентификована додатна група. Систем је састављен од два или више гена који кодирају протеине који цепају само модификоване ДНК секвенце, било метилиране, хидроксиметилиране или хидрометилиране глукозиле.

На пример, ензим ЕцкКМцрБЦ препознаје два динуклеотида општег облика РмЦ; пурин праћен метилираним цитозином, који се може одвојити са неколико парова база - од 40 до скоро 3000. Расцепљивање се одвија око 30 парова база након места које ензим препознаје.

Ендонуцлеасес тип В

Ендонуклезе овог типа су такође познате као „кућне“ ендонуклезе. Ови ензими препознају и пресечу циљну ДНК секвенцу на јединственим местима у геному од 14 до 40 бп.

Ови ензими су често кодирани у интронима и верује се да њихова функција потиче хоризонтални пренос пресечених секвенци. Након сечења долази до поправке прекида у двострукој спирали ДНК на основу комплементарне секвенце.

Примери

Ендонуцлеасе И из Е. цоли делује као одбрамбени систем против фага и паразита. Налази се углавном између цитоплазматске мембране и ћелијске стијенке. Он ствара дволанчане прекиде у страној ДНК са којима интеракцију у периплазматском простору.

ЦРИСПР-Цас ендонуклезе су ензими који делују на одбрамбени механизам многих врста бактерија. Они идентификују и изрезују специфичне секвенце ДНК из инвазивних организама, који су углавном вируси.

Недавно су истраживачи са Масачусетског технолошког института (МИТ) открили систем за уређивање генома ЦРИСПР-Цас12бм са високом прецизношћу за модификацију људских ћелија.

Референце

1. Буррелл, ММ (ур.). (1993). Ензими молекуларне биологије. Тотова, Њ: Хумана Пресс.
2. Лоенен, ВА, Дриден, ДТ, Ралеигх, ЕА и Вилсон, ГГ (2013). Заштитни ензими типа И и њихови сродници. Истраживање нуклеинских киселина, 42 (1), 20-44.
3. Мурраи, ПР, Росентхал, КС, и Пфаллер, МА (2017). Медицинска микробиологија + СтудентЦонсулт на шпанском + СтудентЦонсулт. Елсевиер Хеалтх Сциенцес.
4. Натханс, Д., Смитх, ХО (1975). Рестриктивна ендонуклеаза у анализи и реструктурирању молекула ДНК. Годишњи преглед биохемије, 44 (1), 273-293.
5. Пингоуд, А., Фукреитер, М., Пингоуд, В., & Венде, В. (2005). Ендонуклеаза рестрикције типа ИИ: структура и механизам. Науке о ћелијском и молекуларном животу, 62 (6), 685.