РЕСТРИКТИВНИ ЕНЗИМИ: ФУНКЦИЈЕ, ВРСТЕ И ПРИМЕРИ - БИОЛОГИЈА - 2025

У ензими рестрикције су ендонуклеазе запослена одређеним арцхаеа и бактеријама да инхибирају или "ограничи" ширење вируса унутра. Посебно су честе у бактеријама и део су њиховог система одбране против страних ДНК, познатих као систем рестрикције / модификације.

Ови ензими катализирају цепање двопојасне ДНК на одређеним локацијама, репродуктивно и без употребе додатне енергије. Већина захтева присуство кофактора као што је магнезијум или други двовалентни катиони, мада неки такође захтевају АТП или С-аденозил метионин.

Реакциона шема рестрикционих ензима ХиндИИИ (Извор: Хеликитта виа Викимедиа Цоммонс)

Рестриктивне ендонуклеазе открили су 1978. Даниел Натханс, Арбер Вернер и Хамилтон Смитх, који су за своје откриће добили Нобелову награду за медицину. Њихово име углавном потиче од организма тамо где су први пут посматрани.

Такви ензими се широко користе у развоју метода клонирања ДНК и других молекуларних биологија и стратегија генетског инжењеринга. Њихове специфичне карактеристике препознавања секвенци и способност сече секвенце близу места препознавања чине их моћним алатима у генетском експерименту.

Фрагменти генерисани рестрикцијским ензимима који су деловали на одређени молекул ДНК могу се користити за рекреирање „мапе“ оригиналног молекула коришћењем информација о местима на којима је ензим пресекао ДНК.

Неки рестрикциони ензими могу имати исто место препознавања на ДНК, али не морају га сечи на исти начин. Дакле, постоје ензими који пресецају остатке тупих крајева и ензими који режу преостале кохезивне крајеве, који имају различиту примену у молекуларној биологији.

Тренутно постоје стотине различитих комерцијално доступних рестриктивних ензима које нуде различите комерцијалне куће; Ови ензими функционишу као "прилагођене" молекуларне маказе за различите сврхе.

Карактеристике

Рестриктивни ензими испуњавају супротну функцију полимераза, јер хидролизирају или прекидају естерску везу унутар фосфодиестерске везе између суседних нуклеотида у нуклеотидном ланцу.

У молекуларној биологији и генетском инжењерингу они се широко користе алата за изградњу вектора експресије и клонирања, као и за идентификацију специфичних секвенци. Такође су корисни за изградњу рекомбинантних генома и имају велики биотехнолошки потенцијал.

Недавни напредак у генској терапији користи тренутну употребу рестрикционих ензима за уношење одређених гена у векторе који су возила за транспорт таквих гена у живе ћелије и који вероватно имају могућност убацивања у ћелијски геном да би обављали сталне промене.

Механизам дејства

Рестриктивни ензими могу катализирати цепање ДНК у два опсега, иако су неки способни да препознају једнопојасне ДНК секвенце, па чак и РНК. Резање настаје након препознавања секвенци.

Механизам дејства састоји се од хидролизе фосфодиестерске везе између фосфатне групе и деоксирибозе у костуру сваког ланца ДНК. Многи ензими могу се пресећи на истом месту које препознају, док други режу између 5 и 9 пари пара пре или после њега.

Нормално се ови ензими режу на 5 'крају фосфатне групе, стварајући фрагменте ДНК са 5' фосфорилним крајем и 3 'крајњим хидроксилним крајем.

Пошто протеини не долазе у директан контакт са местом препознавања у ДНК, они се морају премештати сукцесивно све док се специфично место не постигне, можда помоћу "клизних" механизама на ланцу ДНК.

За време ензимског цепања, фосфодиестерска веза сваке од ДНК ланаца је смештена унутар једног од активних места рестрикционих ензима. Када ензим напусти место препознавања и цепања, то чини преко неспецифичних пролазних асоцијација.

Врсте

Тренутно је познато пет врста рестрикцијских ензима. Ево кратког описа сваког од њих:

Заштитни ензими типа И

Ови ензими су велики пентамерни протеини са три подјединице, једна за рестрикцију, једна за метилацију и једна за препознавање секвенци у ДНК. Ове ендонуклезе су мултифункционални протеини који су у стању да катализују рестрикцијске и модификационе реакције, имају АТПазну активност и такође ДНК топоизомеразу.

Ензими ове врсте били су први откривени ендонуклези, први пут су пречишћени 1960-их и од тада су проучавани у велику дубину.

Ензими типа И нису широко коришћени као биотехнолошки алат, јер место цепања може бити на различитој удаљености до 1.000 базних парова од места препознавања, што их чини непоузданима у погледу експерименталне обновљивости.

Рестриктивни ензими типа ИИ

Они су ензими састављени од хомодимера или тетрамера који режу ДНК на дефинисаним местима дужине између 4 и 8 бп. Ова места цепања су обично палиндромна, то јест препознају секвенце које се читају на исти начин у оба смера.

Многи рестриктивни ензими типа ИИ разрежу ДНК када препознају његов страни карактер, јер он нема типичне модификације које би требало да има сопствени ДНК.

Ово су најједноставнији рестрикциони ензими јер за препознавање и сечење ДНК секвенце не треба никакав кофактор осим магнезијума (Мг +).

Прецизност рестрикцијских ензима типа ИИ у препознавању и резању једноставних секвенци у ДНК на прецизним позицијама чини их једним од најчешће коришћених и неопходним у већини грана молекуларне биологије.

Унутар групе рестрикцијских ензима типа ИИ постоји више поткласа разврстаних према одређеним својствима која су јединствена за свакога. Класификација ових ензима врши се додавањем слова абецеде, од А до З пратећи назив ензима.

Неке од подразреда које су најпознатије по корисности су:

Подразред ИИА

Они су димери различитих подјединица. Препознају асиметричне секвенце и користе се као идеални прекурсори за стварање резних ензима.

Подразред ИИБ

Они су састављени од једног или више димера и исечени ДНК са обе стране секвенце препознавања. Пресекли су обе ланце ДНК интервал основног пара испред места препознавања.

Подразред ИИЦ

Ензими ове врсте су полипептиди са функцијама поделе и модификације ДНК ланаца. Ови ензими режу обе нити асиметрично.

Подразред ИИЕ

Ензими овог подразреда се највише користе у генетском инжењерингу. Имају каталитичко место и углавном захтевају алостерни ефектор. Ови ензими морају да ступају у интеракцију са две копије своје препознавајуће секвенце да би извршили ефикасно цепање. У оквиру овог подразреда су ензими ЕцоРИИ и ЕцоРИ.

Заштитни ензими типа ИИИ

Ендонуклеазе типа ИИИ рестрикције састоје се од само две подјединице, једна је одговорна за препознавање и модификацију ДНК, док је друга одговорна за цепање секвенци.

Овим ензимима су потребна два кофактора за своју функцију: АТП и магнезијум. Рестриктивни ензими ове врсте поседују два асиметрична места препознавања, премештају ДНК на АТП-зависан начин и режу га између 20-30 бп поред места за препознавање.

Рестриктивни ензими типа ИВ

Ензими типа ИВ су лако препознати, јер сечу ДНК траговима метилације, они се састоје од више различитих подјединица које су одговорне за препознавање и резање ДНК секвенце. Ови ензими користе ГТП и двовалентни магнезијум као кофакторе.

Специфична места цепања укључују нуклеотидне ланце са метилираним или хидроксиметилираним остацима цитозина на једном или на оба ланца нуклеинских киселина.

Заштитни ензими типа В

Ова класификација групише ензиме типа ЦРИСПЕР-Цас, који идентификују и изрезују специфичне секвенце ДНК из инвазивних организама. Цас ензими користе ланац ЦРИСПЕР-овог синтетизованог водича РНА да препознају и нападају организме који нападају.

Ензими класификовани као тип В су полипептиди структурирани према ензимима И, ИИ и ИИ. Они могу исећи делове ДНК готово било ког организма и са широким распоном дужине. Њихова флексибилност и једноставна употреба чине ове ензиме једним од најчешће коришћених алата у генетском инжењерингу данас, заједно са ензимима типа ИИ.

Примери

Рестриктивни ензими коришћени су за откривање ДНК полиморфизама, посебно у популацијским генетичким студијама и еволуцијским студијама помоћу митохондријске ДНК, како би се добили подаци о брзини нуклеотидних супституција.

Тренутно вектори који се користе за трансформацију бактерија у различите сврхе поседују места мултиклонирања на којима се налазе места препознавања вишеструких рестрикцијских ензима.

Међу тим ензимима најпопуларнији су ЕцоРИ, ИИ, ИИИ, ИВ и В, добијени и описани по први пут од Е. цоли; ХиндИИИ од Х. инфлуензае и БамХИ из Б. амилоликуефациенс.

Референце

1. Бицкле, ТА и Кругер, ДХ (1993). Биологија ограничења ДНК. Микробиолошки прегледи, 57 (2), 434–450.
2. Боиавал, П., Моинеау, С., Ромеро, ДА и Хорватх, П. (2007). ЦРИСПР обезбеђује стечену отпорност против вируса у прокариотима. Наука, 315 (март), 1709–1713.
3. Гоодселл, Д. (2002). Молекуларна перспектива: Рестрицтион Ендонуцлеасес. Матичне ћелије, основе медицине рака, 20, 190–191.
4. Халфорд, СЕ (2001). Скакање, скакање и петља помоћу рестрикцијских ензима. Трансакције биохемијског друштва, 29, 363-373.
5. Јелтсцх, А. (2003). Одржавање идентитета врста и контрола спецификације бактерија: нова функција за рестрикцијске / модификационе системе? Гене, 317, 13-16.
6. Кребс, Ј., Голдстеин, Е. и Килпатрицк, С. (2018). Левинови гени КСИИ (12 ед.). Бурлингтон, Массацхусеттс: Јонес & Бартлетт Леарнинг.
7. Ли, И., Пан, С., Зханг, И., Рен, М., Фенг, М., Пенг, Н., … Схе, К. (2015). Употреба ЦРИСПР-Цас система типа И и ИИИ типа за уређивање генома. Истраживање нуклеинских киселина, 1–12.
8. Лоенен, ВАМ, Дриден, ДТФ, Ралеигх, ЕА и Вилсон, ГГ (2013). Заштитни ензими типа И и њихови сродници. Истраживање нуклеинских киселина, 1–25.
9. Натханс, Д., Смитх, ХО (1975). Рестрикција Ендонуцлеасес у анализи и реструктурирању молекула ДНК. Анну. Влч. Биоцхем. , 273–293.
10. Неи, М., и Тајима, Ф. (1981). Дна полиморфизам који се може открити рестрикцијским ендонуклеазама. Генетика, 145-163.
11. Пингоуд, А., Фукреитер, М., Пингоуд, В., & Венде, В. (2005). Ћелијска и молекуларна наука о ограничењу ендонуклеазе: структура и механизам. Науке о ћелијском и молекуларном животу ЦМЛС, 62, 685–707.
12. Робертс, Р. (2005). Како су рестрикциони ензими постали радни коњи молекуларне биологије. ПНАС, 102 (17), 5905–5908.
13. Робертс, РЈ, и Мурраи, К. (1976). Рестрицтион ендонуцлеасес. Критички осврти у биохемији, (новембар), 123-164.
14. Стоддард, БЛ (2005). Структура и функција домаћих ендонуклеаза. Квартални прегледи биофизике, 1–47.
15. Тоцк, МР, и Дриден, ДТФ (2005). Биологија рестрикције и анти-рестрикције. Тренутно мишљење из микробиологије, 8, 466–472. хттпс://дои.орг/10.1016/ј.миб.2005.06.003
16. Вилсон, ГГ, и Мурраи, НЕ (1991). Системи за ограничавање и модификацију. Анну. Влч. Генет. , 25, 585-627.
17. Ву, З., & Моу, К. (2016). Геномски увид у вируленцију Цампилобацтер јејуни и популацијску генетику. Инфец. Дис. Трансл. Мед., 2 (3), 109–119.
18. Иуан, Р. (1981). Структура и механизам вишенаменских рестриктивних ослобађања. Анну. Влч. Биоцхем. , 50, 285-315.