ПРОТЕИНАЗА К: КАРАКТЕРИСТИКЕ, ЕНЗИМСКА АКТИВНОСТ, ПРИМЕНЕ - БИОЛОГИЈА - 2025

К протеиназе је ензим који припада групи серин протеаза, односно има у свом средњем каталитички активан аминокиселина серин и има функцију разбијање пептидна веза хидролизом. Заузврат, овај ензим припада породици протеина субтилисина (пептидаза С8).

Протеиназа К има молекулску масу (МВ) од 28.900 далтона и први пут је изолована 1974. године у екстрактима гљивице албум Енгиодонтиум, раније позната као Тритирацхиум албум Лимбер.

Молекуларна структура протеиназе К. Извор: Ликцхиниадис

Има високу протеолитичку способност, што је доказано способношћу да разгради кератин присутан у коси. Реч кератин на енглеском језику пише "кератин", отуда је названа и "протеиназа К".

Због своје велике снаге да цепа матичне протеине, овај ензим је користан у различитим техникама молекуларне биологије. Првенствено се користи за изоловање и припрему нуклеинских киселина високе молекулске масе (МВ).

Протеиназа К делује ослобађајући нуклеарну ДНК, док уништава протеине и инактивира РНазе и ДНазе, односно елиминише нуклеарне киселине у препаратима ДНК и РНК.

С друге стране, виђено је да протеиназа К може хидролизовати неке денатуриране нативне протеине, што је побудило интересовање истраживача за њену употребу у проучавању прионских протеина (ПрПЦ).

Међутим, упркос великој протеолитичкој потенцији, постоје протеини који су отпорни на деловање протеиназе К. Међу њима су неки ненормални протеини звани приони (ПрПСц), повезани са трансмисијом спонгиформних енцефалопатија.

Карактеристике протеиназе К

Протеиназа К има терцијарну структуру састављену од три слоја, са 7-ланчаним β листом смештеним између два слоја вијака. Како припада породици пептидаза С8, одликује га каталитичка тријада на свом активном месту, чији је редослед секвенци (Асп, Хис и Сер), који их разликује од осталих породица пептидаза.

Овај ензим из групе серинских протеаза карактерише хидролизирањем пептидних веза блиских карбоксилној групи алифатских и ароматичних аминокиселина.

С друге стране, способна је деловати у присуству одређених корозивних супстанци, као што су натријум додецил сулфат (СДС), Трис-ХЦЛ и ЕДТА, који се користе да помогну денатурацији протеина, услед чега они губе своју матичну структуру.

Ово је прелиминарни корак у припреми протеина за технику електрофорезе. Распон пХ на који делује протеиназа К је прилично широк (2,0 до 12,0), са оптималним пХ између 7,5 и 12,0, а његова изоелектрична тачка је 8,9. Као што се може видети, активан је на веома широком опсегу пХ.

Друга карактеристика која се истиче код протеиназе К је њена стабилност у присуству високих температура (50 - 60 ° Ц).

Ензимска активност

Протеиназа К захтева присуство калцијумовог јона, мада то не утиче на његову активност, ако је неопходно за одржавање његове стабилности.

Да би протеиназа К потпуно дигестирала супстрат, потребно је време контакта од отприлике 5 минута до 2 сата.

Међутим, у том смислу, Даза и др. Упоредили су чистоћу ДНК добијене у различитим временима излагања протеинази К, и закључили да продужена инкубација (до 24 х) значајно побољшава квалитет ДНК.

Међутим, у односу на концентрацију ензима протеиназа К који се користи у различитим протоколима, може се рећи да је он врло разнолик.

Може се користити од врло ниских концентрација (5 µг / мл) до концентрација од 500 µг / мл. Али најчешће радне концентрације крећу се од 50-100 µг / мл, нарочито за варење протеина и инактивацију нуклеуса. Иако је за третирање ткива потребна концентрација од 2 мг / мл.

Апликације

Примене су веома широке и могу се сумирати на следећи начин:

-Користи се у варењу протеина и екстракцији ДНК различитим методама као што су: сољење, ПК-СДС, цетил-триметил амонијум бромид (ЦТАБ), модификовани калијум ацетат и екстракција натријум-јодидом.

-Инативација нуклеаза (РНасес и ДНасес).

-У техници ин ситу хибридизације (ХИС), ради ослобађања нуклеинске киселине, поред елиминисања нежељених протеина.

-Модификација протеина.

-На нивоу истраживања, у разним студијама.

Предности протеиназе К

Извршено је неколико компаративних студија између техника екстракције ДНК које користе протеиназу К, а остале не користе и сви закључују да су веће користи од употребе ензима. Предности укључују следеће:

Добива се ДНК високе молекулске тежине, високог квалитета и чистоће.

-Екстрахована ДНК је стабилна до 3 месеца.

Екстрахована ДНК може се користити у следећим техникама: Соутхерн блот, ланчана реакција полимеразе (ПЦР), електрофореза, између осталих.

Протеини резистентни на К

Различита испитивања су закључила да се приони (ненормално токсични ПрПСц протеини) разликују од ПрПЦ (матичних) протеина отпорношћу на деловање протеиназе К, док су ПрПЦ осетљиви на њено деловање.

Други аутори су описали да у структури ПрПСц постоје осетљиви делови и други отпорни на протеиназу К. Међутим, оба дела су подједнако токсична и инфективна.

С друге стране, Бастиан и др. 1987. изолирали су 4 протеина од 28, 30, 66 и 76 кда од врсте Спиропласма мирум. За све је откривено да су отпорни на деловање протеиназе К, а имали су и унакрсну реакцију са неким прионима.

Познато је да ова врста може проузроковати катаракту и значајна неуролошка оштећења, а захваљујући Бастиановим научним налазима, између осталих истраживања, покушао је повезати овај микроорганизам са трансмисијом спонгиформне енцефалопатије.

Међутим, етиологија ове дегенеративне неуролошке патологије и данас се приписује прионима.

У том смислу, Бутлер и др. Су 1991. идентификовали и окарактерисали класу протеина резистентног на протеиназу К од 40 кда из два соја Мицопласма хиорхинис. Овај патоген утиче на свиње, инфицирајући њихова ткива, али у овом случају није дошло до унакрсне реакције са тестираним прионима.

Потребно је још истраживања да би се расветлиле многе непознанице у вези с тим.

Референце

1. Бастиан Ф, Јеннингс Р и Гарднер В. 1987. Антисерум на фибрилан протеин повезан са стругаром реагује са протеинима фибрила Спиропласма миру м. Ј. Цлин. Мицробиол. 25: 2430-2431.
2. Даза Ц, Гуиллен Ј, Реи Ј, Руиз В. Процена методе екстракције и пречишћавања ДНК из мишићног ткива фиксираног формалдехидом неидентификованих кадавера. Мед магазин, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Бутлер Г, Котани Х, Конг Л, Фрицк М, Еванцхо С, Станбридге Е ​​и Мцгаррити Г. Идентификација и карактеристике протеиназа отпорних на К-протеине код чланова класе Моллицутес. Инфекција и имунитет, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. Лопез М, Ривера М, Виеттри М, Ларес М, Мороцоима А, Херрера Л и др. Поређење два протокола екстракције ДНА Трипаносома црузи узгајаних у аксенском медијуму. Влч. Перу. Медицинско истраживање у здравству 2014; 31 (2): 222-227. Доступно на: сциело.орг
5. Јименез Г, Виллалобос М, Јименез Е и Палма В. Одређивање ефикасности пет протокола екстракције ДНК из парафинираног материјала за молекуларне студије. Рев Мед Унив Костарика. 2007; 1 (1): 10-19.