ОКСИДАЗНИ ТЕСТ: ОБРАЗЛОЖЕЊЕ, ПОСТУПАК И УПОТРЕБЕ - БИОЛОГИЈА - 2025

Тест оксидазе је дијагностичка метода која показује присуство ензимског комплекса званог цитохром оксидаза ц. Овај систем индукује трансформацију редукованог цитохрома у оксидовани, јер он хвата кисеоник и он заузврат делује као последњи акцептор електрона (Х ⁺ ) у респираторном ланцу.

Израз оксидаза је скраћени начин на који се односи на ензим цитокром оксидаза, такође познат као индофенол оксидаза. У стара времена се веровало да су ензими цитокром оксидаза и индофенол оксидаза два различита ензима, али данас се зна да су исти.

Позитиван и негативан тест оксидазе. Извор: Није наведен аутор читљив аутор. Претпостављени су Алпха.прим ~ цоммонсвики (на основу тврдњи о ауторским правима).

Са своје стране, цитохроми су хемопротеини који садрже гвожђе и употпуњују систем цитокром оксидазе. Цитохроми могу да варирају од врсте до врсте.

Постоје различите врсте цитохрома (цитохроми а1, а2, а3 и 0). Неке бактерије могу произвести само једну, а друге до две или три одједном. У том смислу, присуство цитокрома а и а3 познато је под називом цитохром оксидаза ц. Ово је врста цитохрома која детектира оксидазни тест.

Родови Неиссериа и Псеудомонас садрже цитокром оксидазу ц. Ови родови дају позитиван тест оксидазе, помажући им да се разликују од родова Ацинетобацтер и Стенотропхомонас.

Постоје и други родови који су позитивни на оксидазу.

Основе

Карактеристике система цитохром оксидазе ц

Систем цитокром оксидазе ц делује на следећи начин: микроорганизми позитивни на оксидазу користе кисеоник за стварање енергије аеробним дисањем. Овај систем функционише захваљујући транспорту електрона од донорских супстанци као што су НАДХ ⁺ до супстанци рецептора, у овом случају кисеоника.

То резултира производњом енергије (АТП) и воде или водоник-пероксида, зависно од система цитокром-оксидазе који микроорганизам посједује.

Зато је већина бактерија оксидаза позитивних такође на каталазу, што је неопходан услов за елиминацију насталог хидроген пероксида, пошто је та супстанца токсична за бактерије.

Цитохром оксидаза ц систем је присутан у неким аеробним бактеријама, неким факултативним анаеробима, мало микроаерофичних, а нема стриктних анаероба. Ово последње је разумљиво, будући да строги анаероби не могу да живе у присуству кисеоника, па им недостаје систем цитокром оксидазе.

Принцип испитивања

У овом тесту користи супстанце које делују као вештачки акцептори електрона, замењујући оне природне у ланцу преноса електрона.

Углавном се користе боје попут парафенилендиамина и индофенола, које делују као супстрати рецептора и вештачки даваоци електрона.

Парафенилендиамин оксидира системом цитокром оксидазе ц. Боја у смањеном облику је безбојна, али у оксидованом облику је обојена.

Овако је доказано присуство система цитокром оксидазе ц; будући да ће позитивна реакција створити боју лаванде или плаво љубичасту боју, овисно о коришћеном реагенсу.

С друге стране, ако се последња супстанца која прима електроне у респираторном ланцу разликује од кисеоника, тест оксидазе ће бити негативан (нема производње боје); то је случај са анаеробним микроорганизмима.

Исто тако, ако се цитокром који користи микроорганизам разликује од цитокром оксидазе ц, такође ће дати негативан тест.

Процес

Постоје разни реагенси и протоколи за тест оксидазе, а све у исту сврху.

Реагенси

Ковацсов реагенс, Гордон и МцЛеод реагенс, Нади реагенс, Царпентер, Сухрланд и Моррисон реагенс, и употреба дискова оксидазе.

-Ковацс оксидазни реагенс

Састоји се од 1% тетраметил-п-фенилендиамин дихидроклорида.

Ковацсов реагенс се припрема растварањем 1 г поменуте супстанце у 50 мл дестиловане воде. Подгријава се суптилно док се потпуно не отопи. Пребаците у јантарну боцу довољног капацитета и допуните запремину до 100 мл дестилованом водом. Сачекајте најмање 15 минута пре употребе. Чувати у фрижидеру заштићеном од светлости.

Означен је реагенсом Ковацс оксидазе, да би се разликовао од Ковацсовог реагенса који се користи за откривање индолског теста. Овај реагенс је најосетљивији, мање токсичан, али скупљи од осталих реагенса.

Позитивна реакција ће се показати овим реагенсом са променом боје колоније у лаванду, која брзо постаје љубичаста готово црна. Негативна реакција је евидентна јер у колонији нема промене боје или поприма благу ружичасту боју. Медијум такође може потамнити, али то не значи позитивне реакције.

Уз овај реагенс, време реакције је пресудно, промена боје која се јавља између 5 до 15 секунди сматра се позитивном реакцијом.

-Гордон и МцЛеод реагенси

Састоји се од диметил-п-фенилендиамин дихидроклорида, такође познат као Н-диметил-п-фенилендиамин или п-аминодиметиланилин монохидроклорид. Припрема се као што је описано за реагенс Ковацс оксидазе, замењујући за супстанцу која је укључена.

Овај реагенс је нешто стабилнији од реагенса Ковацс оксидазе, иако су сви реагенси који садрже п-фенилендиамин нестабилни.

Ова реакција је касније, она се тумачи као позитивна са појавом плаво-љубичасте боје у року од 10 до 30 минута.

-Нади реагенс

Састоји се од 1% α-нафтола у етил-алкохолу (95% етанола) и 1% аминодиметиланилина. Смеша се припрема у једнаким деловима и употребљава се апсолутни етил алкохол као разблаживач, док се не добије довољна количина за 100 мл.

-Царпентер, Сухрланд и Моррисон реагенс

Састоји се од 1% п-аминодиметилаланин оксалата. Припремите се на исти начин као што је описано за Ковацс оксидазни реагенс, мењајући одговарајућу супстанцу.

Са припремљеним раствором, тест траке се припремају на следећи начин: 6-8 цм траке филтарског папира Вхатман бр. 1 импрегнирају се са 1% реагенса диметил-п-фенилендиамин оксалата.

Могу се сушити без контакта са металом, чувати у посудама са вијком са сушним средством и чувати у фрижидеру. Ове траке су стабилне до 6 месеци.

То је најстабилнији реагент од свих поменутих, и може да траје и до 6 месеци у раствору. Још једна од позитивних тачака је што не обоји медијум око колоније, ако се користи директно на тањиру.

Појава црвене боје се тумачи као позитиван тест.

-Оксидазни дискови

Ради се о комерцијалним дисковима који су импрегнирани реагенсом за оксидазни тест. На тржишту постоји неколико комерцијалних брендова.

Његова употреба је прилично практична, јер није потребно припремати свеже реагенсе, што олакшава рад. Добивени резултати су поуздани све док су дискови правилно сачувани.

Протоколи

Метода директне плоче, индиректна метода на папиру и употреба дискова импрегнираних оксидазним реагенсима.

-Директна табла

2 или 3 капи било ког од горе поменутих реагенаса додају се у ту сврху директно на колонију (е) која се налази у плочи (медијуму) културе која не садржи глукозу.

Тумачење промене боје колонија или не, а не медијума. Важно време реакције зависи од коришћеног реагенса.

-Непосредна метода на папиру

Одрежите комад филтрирног папира (Вхатман бр. 1) на величину од 6 цм ² и ставите га у празну Петријеву посуду.

Додајте 2 или 3 капи реагенса Ковацс оксидазе на папир, узмите део колоније за проучавање платинастом дршком или дрвеном чачкалицом и раширите је правом линијом на папиру импрегнираном реагенсом. Тумачите у року од 5 до 10 секунди.

Са тракама припремљеним са Царпентер, Сухрланд и Моррисон реагенсом, колонија се шири по сувој траци. Једна трака користи се за тестирање неколико сојева. Тумачите за 10 сек.

-Дискови (м

Суптилно навлажите комерцијалне дискове стерилном дестилованом водом и нанесите на колонију која ће се проучавати. Препоручује се употреба плоча на 35 ° Ц, ако се користе плоче на собној температури или хладњаке, реакција је мало спорија. Тумачите промену боје између 10 и 20 сек.

Могу се користити колоније садржане у крви или чоколадном агару.

-Дискови (индиректна метода)

Навлажите диск као што је претходно описано. Ставите га у празну Петријеву посуду. Узмите довољну количину колоније за проучавање платинастом дршком или дрвеним чачкалицом и ставите на диск. Тумачите промену боје између 10 и 20 сек.

Употреба

Род Неиссериа и Ацинетобацтер су понекад врло слични морфолошки јер иако је род Ацинетобацтер грм-негативан штап, понекад може попримити кокоидни облик и бити распоређен у паровима, симулирајући род Неиссериа.

У овом случају је тест оксидазе заиста користан. Род Неиссериа је позитиван, а Ацинетобацтер негативан.

Међутим, род Моракелла веома је сличан роду Неиссериа и оба дају позитивну реакцију; Због тога се увијек морају проводити ферментацијски поступци угљикохидрата за коначну идентификацију.

С друге стране, тест оксидазе је користан за разликовање бактерија које припадају породици Ентеробацтериацеае (све негативне оксидазе) од других фермената, попут рода Пастеурелла, Аеромонас, Плесиомонас (позитивна оксидаза).

Род Вибрио и Хелицобацтер су такође позитивни на оксидазу.

КА

Користите познате сојеве бактерије Есцхерицхиа цоли као негативну контролу, а сојеве Псеудомонас аеругиноса као позитивну контролу.

Ограничења

-Рагенси се морају користити свеже припремљени, њихов рок трајања у раствору на собној температури је кратак, јер су врло нестабилни. У хладњаку могу да трају од 5 дана до 2 недеље.

-Рагенти су безбојни, ако мењају боју, морају се одбацити. Оштећени дискови се појављују јер временом потамне.

-Позитивна реакција са реагенсом Ковацс оксидазе између 15-60 сец сматра се одгођеном реакцијом, а након 60 секунди треба је сматрати негативном.

-Хаемопхилус инфлуензае даје негативну реакцију оксидазе ако се користи било који реагенс са диметил-п-фенилендиамином, али позитиван ако се користи реагенс Ковацс оксидазе (тетраметил-п-фенилендиамин).

-Медијуми који садрже глукозу ометају тест, дајући лажне негативности.

-Бордетелла пертуссис сојеви могу дати лажно позитивну реакцију ако долазе из високо концентрованих плоча са агарима крви.

- Употреба металних (жељезних) ручица даје лажно позитивну реакцију.

препоруке

-С обзиром на то да су реагенси врло нестабилни и склони су само-оксидирању, препоручује се замрзавање аликвота од 1 до 2 мл и уклањање према потреби.

-Други начин за одлагање ауто-оксидације реагенса је додавање 0,1% аскорбинске киселине приликом припреме реагенса.

-С обзиром да су реагенси нестабилни, препоручује се недељна контрола квалитета.

-Регенти који не пролазе тест квалитета не би се требали користити.

Референце

1. Конеман Е, Аллен С, Јанда В, Сцхрецкенбергер П, Винн В. (2004). Микробиолошка дијагноза. 5. изд. Редакција Панамерицана СА Аргентина.
2. Форбес Б, Сахм Д, Веиссфелд А. (2009). Баилеи & Сцотт Микробиолошка дијагноза. 12 ед. Редакција Панамерицана СА Аргентина.
3. "Тест оксидазе." Википедија, Слободна енциклопедија. Јан 15 2018, 10:32 УТЦ 3 април 2019, 14:03
4. Светска здравствена организација. Приручник за лабораторију за идентификацију и тестирање осетљивости на антимикробне лекове бактеријских патогена од значаја за јавно здравље у свету у развоју, 2004. Доступно на: вхо.инт/другресистанце/инфосхаринг
5. Траке реагенса за дијагнозу активности оксидазе у бактеријама. Рев Кубана Мед Троп. 2000; 52 (2): 150-151.