МРЉА ОД ГИЕМСА: ОБРАЗЛОЖЕЊЕ, МАТЕРИЈАЛИ, ТЕХНИКА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЈА - 2025

Гиемса мрља је тип бојења клиничких узорака, на основу мешавине киселих и базних боја. Његово стварање инспирисано је радом Романовског, где је Густав Гиемса, хемичар и бактериолог пореклом из Немачке, усавршио је додавањем глицерола за стабилизацију једињења.

Промене настале у оригиналној Романовској техници омогућиле су значајно побољшање микроскопских осматрања, па је техника крштена именом Гиемса мрља.

Различити узорци обојени Гиемса флеком. А. Трипаносома еванси у периферној крви. Б. Нормалне ћелије крви. Ц. Боррелиа тхеилери у периферној крви. Д. Буркиттов лимфом.

Пошто је то једноставна техника, високо функционална и економична, тренутно се широко користи у клиничкој лабораторији за хематолошке брисе, узорке коштане сржи и одсеке ткива.

Техника бојења Гиемса врло је корисна за цитолошке студије јер омогућава посматрање специфичних ћелијских структура. Овом техником се мрљају цитоплазме, језгре, нуклеоли, вакуоле и грануле ћелија, способни су да разликују чак и фине трагове хроматина.

Даље, могу се открити значајне промене у величини, облику или боји језгра, где је могуће визуализовати губитак односа језгра и цитоплазма.

С друге стране, омогућава идентификацију незрелих ћелија у коштаној сржи и периферној крви, што је важно за дијагнозу озбиљних болести, попут леукемије. Такође је могуће, између осталог, открити хемопаразите, екстра и унутарћелијске бактерије, гљивице.

У цитогенетици се широко користи, јер је могуће проучавати митозу ћелија.

Основе бојења Гиемса

Боје типа Романовски заснивају се на коришћењу контраста између киселих и базичних боја како би се постигло обојење базичне и киселинске структуре. Као што се може видети, постоји афинитет киселих боја за бојење основних структура и обрнуто.

Основно обојено средство је метилен плаво и његови оксидовани деривати (Азуре А и Азуре Б), док је кисело бојило еозин.

Киселе структуре ћелија су нуклеинске киселине, грануле сегментираних базофила, између осталог, стога ће бити обојене метилен плавим.

У том истом смислу, основне структуре ћелија су хемоглобин и неке грануле, попут оних садржаних у сегментираним еозинофилима, између осталог; оне ће бити обојене еозином.

С друге стране, због чињенице да су метилен плави и азурни карактеристични по метахроматским бојама, они могу да дају различиту нијансу различитим структурама у складу са оптерећењем полианија који поседују.

Овако стратешка комбинација базичних и киселих боја успева да развије широк спектар боја, према биохемијским карактеристикама сваке структуре, ходајући кроз бледо плаву, тамноплаву, љубичасту и љубичасту нијансу у случају киселих структура.

Док је обојење које пружа еозин стабилније, ствара боје између црвено-наранџасте и лососа.

материјали

Материјали за припрему основног раствора

За припрему основног раствора потребно је вагати 600 мг праха Гиемса мрље, мерено 500 мл метил-алкохола без ацетона и 50 мл неутралног глицерина.

Како припремити основни раствор

Тешки прашак Гиемса ставите у малтер. Ако има грудвице, треба их прскати. Након тога додајте уочљиву количину измереног глицерина и добро измешајте. Добијена смеша се сипа у веома чисту амбре боцу.

Остатак глицерина се ставља у малтер. Поново мешајте да бисте очистили остатак боје која се залепила на зидовима малтера и сипајте у исту теглу.

Боца се затвори и стави у водену купељ на 55 ° Ц током 2 сата. Док се налази у воденој купељи, њежно протресите смешу сваких пола сата.

Након тога се смеша охлади да се стави алкохол. Претходно се део измереног алкохола стави у малтер да би се завршило испирање преосталог обојења, а затим се додаје у смешу заједно са остатком алкохола.

Овај препарат треба оставити да сазри најмање 2 недеље. Искоришћени део основног раствора треба филтрирати.

Да би се избегла контаминација препарата, препоручује се део који ће бити у сталној употреби пребацити у малу амберну бочицу са капалицом. Долијте сваки пут када се реагент потроши.

Материјали за припрему пуфер раствора

Са друге стране, пуферски раствор са пХ 7,2 се припрема на следећи начин:

6,77 г натријум-фосфата (безводног) (НаХПО ₄ ), 2,59 г калијум дихидроген фосфата (КХ ₂ ПО ₄ ) и дестилована вода се измери до 1000 ццм.

Завршна припрема боје

За припрему коначног раствора за бојење се мери 2 мл филтрираног основног раствора и помеша се са 6 мл пуфер раствора. Мешајте смешу.

Важна чињеница која се мора узети у обзир је да се технике припреме обојења могу мењати у зависности од комерцијалне компаније.

Додатни материјали потребни за обављање бојања

Поред описаних материјала, за прање морате да имате и мостове за бојање, мајице са водом или тампон, праменове предмета или поклопце за предмете, штоперицу за контролу времена бојања и папир за размазивање или неки други материјал који се може користити за сушење ( газа или памук).

Техника

Процес бојења

1) Пре бојења, мрља узорка мора бити спремна на чистом стаклу.

Узорци могу бити крв, коштана срж, хистолошки одсеци ткива или цервико-вагинални узорци. Препоручује се да намази буду танки и имају 1 или 2 сата сушења пре бојења.

2) На мост за бојење ставите све листове који морају бити обојени. Увек радите истим редоследом и сваки лист је добро идентификован.

3) Ставите неколико капи 100% метилног алкохола (метанол) на брис и оставите да делује 3 до 5 минута, како би се узорак учврстио и дехидрирао.

4) Одбаците метанол присутан на листу и оставите да се осуши на ваздуху.

5) Једном када се осуши, крајњу отопину за бојење ставите капаљком док се цео лист не покрије. Оставите да делује 15 минута. Неки аутори препоручују до 25 мин. Зависи од пословне куће.

6) Отопите мрљу и исперите размаз дестилованом водом или 7,2 пуфер раствором.

7) На папиру за умотавање пустите да се листови осуше на отвореном, постављени вертикално уз помоћ носача.

8) Очистите стражњу страну клизача алкохолним тампоном или памучним тампоном како бисте уклонили све трагове мрља.

Комуналије

Техника бојења Гиемса користи се у различитим областима, укључујући: хематологију, микологију, бактериологију, паразитологију, цитологију и цитогенетику.

Хематологија

То је најчешћа употреба која се даје овој мрљи. Помоћу ње може се идентификовати свака ћелија присутна у узорцима коштане сржи или периферне крви. Као и процену броја сваке серије, могућност откривања леукоцитозе или леукопеније, тромбоцитопеније итд.

Пошто је осетљив у препознавању незрелих ћелија, релевантан је у дијагностици акутне или хроничне леукемије. Такође је могуће поставити дијагнозу анемије, попут српасте ћелије, између осталих.

Мицологи

У овом подручју, његова употреба је уобичајена за претрагу Хистопласма цапсулатум (унутарћелијске диморфне гљивице) у узорцима ткива.

Бактериологија

У хематолошким мрљама обојеним Гиемса могуће је открити Боррелиас сп код пацијената који имају болест која се зове рецидивна грозница. Спирохета има у изобиљу међу еритроцитима, у узорцима узетим на врхунцу грознице.

Такође је могуће визуелизовати интрацелуларне бактерије као што су Рицкеттсиа сп и Цхламидиа трацхоматис у инфицираним ћелијама.

паразитологија

У области паразитологије, бојење Гиемсе је омогућило дијагностицирање паразитских болести као што су маларија, Цхагасова болест и леисхманиасис.

У прва два паразита Пласмодиум сп и Трипаносома црузи могу се видети у периферној крви заражених пацијената, могу се наћи у различитим фазама у зависности од фазе у којој је болест.

Да бисте побољшали потрагу за паразитима у крви, препоручује се употреба флеке Гиемса помешане са мрљу Маи-Грунвалд.

Слично томе, кожна лајманијаза може се дијагностиковати проценом узорака биопсије обојене Гиемса где је паразит пронађен.

Цитологија

Бојење Гиемса се такође користи за цитолошко испитивање ендоцервикалних узорака, мада то није најчешће коришћена техника у ту сврху.

Али у случајевима оскудице ресурса може се користити, имајући сличну функцију као и Папаницолаоу техника и по нижим ценама. Међутим, за то је потребна стручност испитивача.

Цитогенетика

Важна карактеристика бојења Гиемса је његова способност да се веже снажно за аденинске и тиминске дијелове ДНК. То омогућава визуелно представљање ДНК током ћелије митозе, у различитим стањима кондензације.

Ова истраживања су неопходна за откривање кроматских аберација попут дупликација, брисања или транслокација различитих региона хромозома.

Истраживање које показује ефикасност флека од Гиемса

Цаннова и др. (2016), упоређивали су 3 технике бојења за дијагнозу кожне лишманијозе.

За то су користили узорке добијене од експерименталне животиње (Месоцрисетус ауратус) експериментално инокулиране Леисхманиасом.

Аутори су показали да је флека од Гиемса боља од мрље Пап-март® и Гаффнеи. Стога су мрљу Гиемса сматрали идеалном за дијагностицирање кожне лишманијозе.

Одлични резултати које су добили аутори резултат су чињенице да комбинација боја, која чине Гиемса смешу, представља неопходне услове за стварање повољног контраста, омогућујући јасно разликовање структура амастигота, како унутар, тако и ванћелијски.

И друге технике (Пап-март® и Гаффнеи) су то урадиле, али на слабији начин и зато теже визуелно примене. Због тога се мрља Гиемса препоручује за паразитолошку дијагнозу леисхманиасис.

Исто тако, студија Рамирез ет ал. (1994) проценила је ваљаност мрља Гиемса и Лендрум у коњунктивним размазима за идентификацију Цхламидиа трацхоматис.

Аутори су утврдили да мрље Гиемса и Ледрум имају једнаку специфичност, али је откривено да је Гиемса осетљивија.

Ово објашњава зашто се мрља Гиемса тренутно најчешће користи за дијагнозу хламидијалних инфекција, посебно ако има мало ресурса.

Извор: ПанРеац Апплицатионхем ИТВ реагенси. Гиемса мрља. Верзија 2: ЈМБЈУЛ17 ЦЕИВД10ЕС. Цастеллар дел Валлес, Шпанија.

Препоруке за добро бојење

Сушење листова не би требало убрзавати. Очекује се разумна количина времена за сушење на отвореном. Отприлике 2 сата.

Боја одмах након 2 сата за најбоље резултате.

Да би се мрље боље фиксирале и запрљале, узорак се мора расподелити на клизачу тако да остане танак и уједначен слој.

Пожељни узорак крви је капиларни, јер се маза прави директно из капи крви, па узорак не садржи никакве адитиве, што погодује одржавању ћелијских структура.

Међутим, ако се користи венска крв, ЕДТА треба да се користи као антикоагулант, а не хепарин, јер хепарин обично деформише ћелије.

Честе грешке у бојењу Гиемса

У пракси ове бојења могу се учинити грешке. О њима сведоче нагле промене у тоналитетима структура.

Изузетно плаво бојање

То може бити последица:

• Веома густе мрље
• Прекорачење времена бојења
• Прати се недовољно.
• Употреба реагенса знатно изнад неутралног (алкалног) пХ.

Под овим условима, боје следећих структура су изобличене, на такав начин да ће еритроцити уместо да обоје лосос-ружичасту изгледати зелено, грануле еозинофила које морају бити обојене цигле црвеном постају плавкасто или сиво и тако даље одступање у уобичајеним тоновима.

Прекомерно розе боје

То може бити последица:

• Недовољно време бојења.
• Дуго или прекомерно прање.
• Лоше сушење.
• Употреба високо киселинских реагенса.

У овом конкретном случају, структуре које се обично обоје у плаво неће бити готово видљиве, док ће структуре које обојају ружичасто имати много претеране нијансе.

Пример: Црвена крвна зрнца постаће јарко црвена или јарко наранџаста, нуклеарни хроматин ће се појавити бледо ружичаст, а грануле еозинофила ће обојати дубоко јарко црвену боју.

Присуство талога у брису

Узроци могу бити:

• Користите прљаве или лоше испране филмове.
• Не дозволите да се мирис добро осуши.
• Решење за причвршћивање оставља се предуго.
• Неадекватно прање на крају бојења.
• Неадекватна филтрација или не филтрирање обојеног обојења.

Присутност морфолошких артефаката

Морфолошки артефакти се могу појавити у брисима, што отежава визуализацију и интерпретацију присутних структура. Ово је требало да:

• Врста употребљеног антикоагуланса, као што је хепарин.
• Употреба прљавих, покварених или масних филмова.

Режим складиштења

Након припреме, бојило се мора чувати на собној температури (15 - 25 ° Ц), да се спречи таложење боје. Треба га чувати у добро затвореном контејнеру ћилибара.

Референце

1. Цаннова Д, Брито Е и Симонс М. Процена техника бојења за дијагнозу кожне лишманијозе. Салус. 2016; 20 (2): 24-29.
2. ПанРеац Апплицатионхем ИТВ реагенси. Гиемса мрља. Верзија 2: ЈМБЈУЛ17 ЦЕИВД10ЕС. Цастеллар дел Валлес, Шпанија.
3. Цларк Г. Поступци бојења (1981), 4тхед. Виллиамс и Виллкинс.
4. Примењена клиничка хемија. Боја Гиемса за ин витро дијагностику. Дистрибутер: цромакит.ес
5. Рамирез И, Мејиа М, Гарциа де ла Рива Ј, Хермес Ф и Гразиосо Ц. Валидност мрља Гиемса и Лендрум у коњунктивним мрљама за идентификацију Цхламидиа трацхоматис. Бол из Санит Панама. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Цасас-Ринцон Г. Општа микологија. 1994. Друго издање Централног универзитета у Венецуели, издања библиотека. Венезуела Царацас.
7. "Мрља од Гиемса." Википедија, Слободна енциклопедија. 1 сеп 2017, 01:02 УТЦ 6. децембра 2018. ес.википедиа.орг.