СЕКВЕНЦЕ ДНК: МАКАМ-ГИЛБЕРТ, МЕТОДА И ПРИМЕРИ - БИОЛОГИЈА - 2025

ДНК секвенцирање (дезоксирибонуклеинске киселине) је поступак у лабораторијама молекуларне биологије који омогућава да знају редослед нуклеотида у генетичком материјалу од интереса. Даље, секвенционирање РНА (рибонуклеинска киселина) такође се може открити.

Ова техника је била неопходна за развој биолошких наука. Такође је применљиво на друга подручја знања - на пример, на пример медицинску дијагнозу и форензичке истраге.

Извор: пикабаи.цом

Раније је секвенционирање ланца ДНК сматрано спором и скупом активношћу, што је омогућило идентификацију само неколико базних парова у олигонуклеотидима.

Данас, уз сав напредак науке, секвенцирање ДНК је рутинска операција у многим лабораторијама широм света захваљујући доприносу скоро 50 година истраживања у овој области. У погледу дужине ланца, до милион базних парова може бити секвенцирано у врло кратком року.

Да бисте то постигли, развијене су десетине техника које се разликују у цени и прецизности. У овом чланку ћемо описати и класичне и модерне технике, свака са својим предностима и недостацима.

До сада, технике секвенцирања омогућавају добијање секвенце комплетних генома, од малих прокариота и квасца до људског генома.

Структура ДНК

Да бисмо разумели методе и технике које се користе за секвенцирање ДНК, потребно је знати одређене кључне аспекте структуре и састава молекула.

ДНК је биомолекула која се налази у свим живим бићима, од бактерија до великих водених животиња. Органеле - попут митохондрија и хлоропласта - имају кружни молекул ДНК у себи. Чак и код неких вируса пронађени генетски материјал је ДНК.

Структурно, ДНК је колекција нуклеотида. Свака се састоји од угљених хидрата, азотне базе (А, Т, Ц или Г) и фосфатне групе. Циљ секвенцирања ДНК је откривање редоследа у коме се налазе четири азотне базе у низу.

Историја

Средином 1950-их, истраживачи Ватсон и Црицк описали су структуру ДНК кристолографским техникама. Међутим, ниједан од ових истраживача није успео да нађе начин да открије тај низ.

Иако је било одређених претходника, најважнији догађај је стварање методе Сангер, 1977. Фредерицк Сангер, отац методе, био је британски биохемичар, добитник две Нобелове награде за свој огроман допринос биолошким наукама.

Ова техника је такође позната у литератури као "прекид ланца" или дидеоксинуклеотиди. Принципи ове технике и они који су развијени на основу њеног унапређења и иновације биће описани у даљем тексту.

Сангер метода

Развој Сангерове методе представљао је кључни догађај у молекуларној биологији. Укључује основне компоненте процеса репликације ДНК који се обично дешавају у ћелији, али додаје посебну компоненту: дидеоксинуклеотиде.

Главне компоненте реакције

- ДНК полимераза: Ензим ДНК полимераза је пресудни елемент процеса. Овај молекул учествује у репликацији ланца ДНК и његова улога је синтеза новог ланца, спаривање трифосфатних деоксирибонуклеотида са комплементарним.

Подсјетимо да се у ДНК тимини (Т) спајају с аденинима (А) кроз двије водоничне везе, док цитозин (Ц) то чини с гванином (Г) кроз три везе.

- Нуклеотиди: Сигурније секвенционирање укључује две врсте нуклеотида, четири 2'-деоксиннуклеотида (скраћено дАТП, дГТП, дЦТП и дТТП) и четири дидеоксинуклеотида (ддАТП, ддГТП, ддЦТП и ддТТП).

Иако су дидеоксинуклеотиди слични мономерима који се нормално уграђују у ДНК, они немају -ОХ групу у својој структури. То онемогућава додавање новог нуклеотида у ланац.

Стога, када се дода посебан нуклеотид - на сасвим случајни начин - ланцу у формирању, синтеза је парализована. Тако на крају реакције постоје ланци различитих величина, од којих је сваки заустављен у различитој тачки.

Експериментално су припремљена четири теста. Свака садржи ДНК издвојену из биолошког узорка који вас занима, нормалне нуклеотиде и једну од четири посебне врсте нуклеотида. Или су посебни нуклеотиди обележени неком врстом флуоресцентног маркера (види доле аутоматизовано секвенцирање).

Читање резултата

Први корак је одвајање сваког од синтетизованих ланаца у складу са њиховом величином. Неке ће бити дуже од других, у зависности од тога где су посебне базе уграђене.

Постоје различите биохемијске технике које омогућавају одвајање компоненти смеше користећи величину као дискриминаторно својство. Код Сангерове методе различити ланци су раздвојени електрофорезом. У софистициранијим варијантама технике користи се капиларна електрофореза.

Стога дужи праменови путују мање од краћих варијанти. Овај систем затим пролази кроз читач који препознаје маркер који је укључен у сваки дидеоксинуклеотид. На овај начин се може знати редослед редоследа.

Ова "прва генерација" техника може да чита ДНК фрагменте не веће од 1 килобаза. Тренутно се Сангерова метода користи у разним лабораторијама, углавном у њеним модерним варијантама. Поред тога, користи се за потврђивање резултата добијених најсложенијим техникама - али мање прецизним.

Аутоматско секвенцирање

Када је потребно секвенцирање у великом обиму, процес се убрзава аутоматизацијом. Ово је варијација поступка прекида Сангеровог ланца, где су прајмери ​​обележени флуоресцентним производима да би се разликовали.

Након тога, производ реакције се покреће електрофорезом - све на једној траци. Како сваки фрагмент излази из последњег дела гела, брзо се препознаје флуоресцентним обележавањем, са грешком око 1%.

Најсофистициранији системи имају систем до 96 капиларних цеви којима управља рачунар спојен са роботом. Односно, 96 узорака ДНК се може истовремено тестирати. Дакле, процес који укључује електрофорезу и анализу резултата у потпуности је аутоматизован.

У једном дану, ови системи могу да прате до 550.000 база. Током процеса, људски рад је непотребан, потребно је само око 15 минута за покретање методе.

Макам-Гилберт секвенцирање

У исто време када је Сангер објавио своје дело, два истраживача по имену Аллан Макан и Валтер Гилберт успели су да развију другу методу за добијање ДНК секвенце. Метода је тада стекла популарност, али је касније измијењена побољшањем Сангерове методе.

Супротно Сангеровој методи, Макан и Гилберт секвенција (или хемијско секвенцирање, као што је такође познато) не укључују реакције хибридизације. Методологија се састоји од обележавања реактивним средствима на једном крају, након чега следи поступак пречишћавања.

Један од негативних аспеката ове технике лежи у огромној сложености и употреби хемикалија које су опасне за корисника. Хемијска пукнута индукује се применом ДМС, мравље киселине, хидразина и хидразина са солима.

Процес

Протокол започиње обележавањем на 5 'крају нити у односу на фосфорни маркер 32, затим долази до хемијске модификације азотне базе и одваја се. Коначно долази до цепања абасицке регије.

Прво скратите низ који желите да слиједите на мање сегменте. Овај корак се изводи са рестрикционим ензимима, што резултира избоченим крајевима.

Затим се реакција изводи са алкалном фосфатазом, чија је сврха елиминација фосфатне групе. Према томе, полинуклеотид киназа се може користити за означавање.

Ланац је денатуриран (две праменове су отворене). Тада се примењују хемикалије. Ове реакције цепања се изводе на контролисан начин и познато је које врсте веза се примењују у хемијским раздвајањима.

Читање резултата

Као и код Сангерове методе, очитавање резултата укључује одвајање према величини ланаца добијених у систему електрофорезе. Системи сачињени од полиакриламида омогућавају добијање врло адекватне резолуције за очитавање гела.

Масовно секвенцирање

Масивно секвенцирање обухвата низ нових метода, скраћено као НГС, из енглеског „Нект Генератион Секуенцинг“.

Методе класификоване као НГС захтевају претходни корак амплификације ДНК (не раде са једном молекулом). Поред тога, употребљене платформе веома се разликују. Ниже ће бити описани принципи најпопуларнијих метода:

Пиросекуенцес

То укључује праћење ослобађања пирофосфата, које се догађа сваки пут када се у ланцу ДНА дода нови нуклеотид. Систем ензима је повезан тако да се емисија светлости (коју детектује камера) јавља сваки пут када се угради нови нуклеотид.

Процес започиње одвојеном инкубацијом сваке азотне базе да би се потврдило да ли постоји или не. Пироаквизацијом се могу читати дуги низови, али пронађена стопа грешака је висока.

Синтезно секвенционирање

Ово укључује уградњу обележених нуклеотида. Ове флуоресцентне компоненте се додају, исперу и примети се уграђени нуклеотид. Затим се нуклеотидна ознака уклања и синтеза нити се може наставити. У следећем кораку ће бити укључен и обележени нуклеотид, а горе наведени кораци ће бити поновљени.

Недостатак ове технике настаје када флуоресцентни маркери нису у потпуности уклоњени. Ове емисије стварају позадинске грешке, што резултира значајним грешкама.

Секвенцирање лигација

Ова техника се разликује од осталих, јер не користи ДНК полимеразу. Уместо тога, кључни ензим за ову методологију је лигаза. Овде се користе флуоресцентно обележени фрагменти ДНК, повезани су ензимом и детектују се.

Највећи проблем ове технике представља кратка дужина фрагмента која је способна да обради.

Редослед тонског јона

Ова техника се заснива на мерењу Х ⁺ јона који се ослобађа сваки пут када се угради нови нуклеотид. Принцип је прилично сличан пироакцији, али много јефтинији.

Примери

Секвенцирање људског генома

Секвенцирање људског генома био је један од најперспективнијих изазова у биологији, као и једно од најцјењенијих ривалстава у историји науке. Заправо, за научнике укључене у пројекат, секвенционирање генома постало је конкуренција.

1990. године покренуо је оно што се називало „пројект људског генома“, који је водио познати научник, добитник Нобелове награде Џејмс Вотсон. Након годину дана, 1991. године, Вентер је преузео изазов "победити" Ватсона и секвенционирати геном пре њега. Међутим, 1992. године Ватсон се повукао и команду је преузео други истраживач.

1995. године Вентер је објавио успех у потпуном секвенцирању бактеријског генома методом насумичног секвенце. Слично томе, противнички тим објавио је годину касније секвенцију генома квасца.

2000. године стекао је диплому. Обе компаније објавиле су прелиминарне резултате целокупног генома у два најпрестижнија научна часописа: Натуре анд Сциенце.

Међутим, научници су наставили радити на побољшању предлога, а 2006. године су завршени низови одређених хуманих хромозома.

Важност и апликације

Познавање редоследа нуклеотида тако важног молекула као што је ДНК драгоцено је за биологе и сродне стручњаке. Овај ланац полинуклеотида садржи све информације потребне за развој и одржавање свих облика живота.

Из тих разлога, знање о овом низу је од суштинског значаја за биолошка истраживања. У основи, секвенцирање омогућава мерење једног од најважнијих својстава биолошких система и утврђивање разлика међу њима.

Секвенцирање широко користе таксономисти и систематичари, јер одређене секвенце ДНК омогућавају успостављање критеријума за закључивање да ли два организма припадају истој врсти или не, осим што могу предложити хипотезе о филогенетским везама међу њима.

Поред тога, секвенционирање ДНК има примену у медицини и дијагностици. На пример, постоје јефтини и приступачни системи који секвенцирањем омогућавају процену тенденције развоја одређених болести (попут рака) коришћењем такозваних полиморфизама са једним нуклеотидом (СНПс).

Истраживања криминалног и форензичког типа такође су обогаћена техникама секвенцирања, које се могу користити као поуздани докази о учешћу одређене особе у злочину.

Референце

1. Хеатхер, ЈМ, и Цхаин, Б. (2016). Секвенца секвенци: историја секвенцирања ДНК. Геномицс, 107 (1), 1-8.
2. Коболдт, ДЦ, Стеинберг, КМ, Ларсон, ДЕ, Вилсон, РК, & Мардис, ЕР (2013). Револуција секвенцирања нове генерације и њен утицај на геномику. Целл, 155 (1), 27-38.
3. Леви, Ј. (2010). Научна ривалства. Од Галилеа до пројекта хуманог генома. Редакција Паранинфо.
4. Сангер, Ф., Ницклен, С., Цоулсон, АР (1977). Секвенце ДНК са инхибиторима који се завршавају ланцима. Зборник радова Националне академије наука, 74 (12), 5463-5467.
5. Сцхустер, СЦ (2007). Следећа генерација секвенционирање трансформише данашњу биологију. Методе природе, 5 (1), 16.
6. Ксу, Ј. (ур.). (2014). Секвенција следеће генерације. Цаистер Ацадемиц Пресс.