БОЈЕЊЕ СПОРА: ОБРАЗЛОЖЕЊЕ, ТЕХНИКЕ И УПОТРЕБЕ - БИОЛОГИЈА - 2025

Споре обојење је методологија за бојење отпора структуре који чине неку бактерија родова када у неповољним условима; Ове структуре одговарају облику преживљавања.

Постоји много родова који формирају споре; међутим, главни су Бациллус и Цлостридиум. Ови родови се сматрају релевантнијим, јер имају патогене врсте за људе.

Бојење спора помоћу Схаеффер - Фултон или Виртз-Цонклин методе. И тамбе (оригинални уплоадер), са Викимедиа Цоммонс

Сваки бацил може да створи споре. У тренутку бојења препарата, споре се могу наћи унутар бацила (ендоспоре) или ван њега (екоспоре). Уз конвенционалне технике бојења за бактерије - попут мрље по Граму - споре остају безбојне.

Тренутно постоји неколико методологија бојења које су способне да продру у густу структуру спора да би је обојале. Ове методологије су веома разнолике; Они укључују Дорнер-ову технику, Моеллерову мрљу и Схаеффер-Фултон методологију, такође познату и као Виртз-Цонклин.

Од свих наведених техника, Схаеффер-Фултон методологија се највише користи у рутинским лабораторијама. Име је добио по два микробиолога који су 1930. створили боју: Алициа Схаеффер и МацДоналд Фултон. Међутим, техника се понекад назива Виртз-Цонклин по двојици бактериолога из 1900-их.

Основе

Споре се не мрље уобичајеним мрљама, јер имају веома густ зид. Сложен састав спора спречава улазак већине бојила.

Ако се споре проучавају споља, примећују се следећи слојеви: прво је ту егзоспоријум, који је најтањи и спољашњи слој који настаје од гликопротеина.

Слиједи кутикула која пружа отпорност на високе температуре, а слиједи кортекс састављен од пептидогликана. Касније је зид базе који штити протопласт.

Спора је дехидрирана структура која садржи 15% калцијума и дипиколинске киселине. Због тога се већина техника бојења спора ослања на примену топлоте како би боја могла да продре кроз густу структуру.

Једном када се спора обоји, боја не може да се уклони. У техници Схаеффер - Фултон, малахит зелено улази у вегетативне ћелије и када се примени топлота продире у ендоспор као и у егзоспоре.

Испирањем водом, боја се уклања из вегетативне ћелије. То се дешава зато што је малахит зелена боја мало базична, тако да се слабо веже за вегетативну ћелију.

Уместо тога, не може да се извуче из спора и на крају се бацил супротстави сафранину. Овај темељ важи за остале технике у којима се догађа нешто слично.

Технике бојења спора

Да би се извело бојење спора, мора се добити чиста култура сумњивог соја који се проучава.

Култура је изложена екстремним температурама током 24 сата да би се стимулисао микроорганизам да спорули. За то се култура може ставити у рерну на 44 ° Ц или у фрижидер (8 ° Ц) на 24 или 48 сати.

Ако се предуго остави на поменутим температурама, приметиће се само егзоспоре, пошто су сви ендоспоре већ напустили бацил.

На крају времена, неколико капи стерилног физиолошког раствора треба да се стави на чист слајд. Затим се узме мали део културе и направи се фино ширење.

Након тога се оставља да се осуши, фиксира на топлоти и боји се једном од техника објашњених у даљем тексту:

Дорнер техника

1- Припремите у епрувету концентровану суспензију спорулираног микроорганизма у дестилованој води и додајте једнаку запремину филтрираног Киниоун карбол фуксина.

2- Ставите епрувету у каду са кључалом водом између 5 и 10 минута.

3- На чистом тобогану помешајте кап претходне суспензије са капом 10% воденог раствора нигросина, прокухан и филтриран.

4- Раширите и сушите на лаганој ватри.

5- Испитајте са циљем 100Кс (урањање).

Споре мрље црвено, а бактеријске ћелије изгледају готово безбојно на тамно сивој позадини.

Модификована Дорнер техника

1- Суспензија спорулираног микроорганизма се шири на тобоган и фиксира на топлоти.

2- Узорак је прекривен траком филтрирајућег папира коме се додаје карбол фуксин. Колорант се загрева 5 до 7 минута пламеном Бунсеновог горионика док се не створи еволуција пара. Затим се папир уклања.

3- Препарат се испере водом, а затим осуши апсорбирајућим папиром.

4- Покријте мрља танким филмом 10% нигросина, користећи други тобоган за ширење нигросина или иглом.

Обојење спора и бактерија је исто као оно описано у претходном стању технике.

Схаеффер - Фултон или Виртз-Цонклин техника

1- Направите фини мрља суспензијом спорулираног микроорганизма на тобоган и фиксирајте на топлоти.

2- Прекријте клизач 5% воденим раствором малахита зелене боје (на тобоган можете поставити филтер папир).

3- Загријте пламен Бунсен горионика док се пара не ослободи и уклоните пламен. Поновите операцију 6 до 10 минута. Ако раствор малахита зелена испари током поступка, може се додати више.

4- Уклоните филтер папир (ако је уграђен) и оперите водом.

5- Покријте слајд са 0,5% воденим сафранином 30 секунди (неке варијанте технике користе 0,1% водени сафранин и оставите га 3 минута).

Овом техником споре су зелене, а бацили црвени.

Има недостатак што ендоспоре младих култура не мрље добро, пошто изгледају изузетно бистро или безбојно. Да би се то избегло, препоручује се коришћење култура у трајању од 48 сати инкубације.

Моеллер техника

1- Прекријте маза хлороформом 2 минута.

2- Одбаците хлороформ.

3- Прекријте 5 минута хромне киселине.

4- Оперите дестилираном водом

5- Листови су прекривени карболним фуксин-феницадом и изложени пламену Бунсеновог горионика све док не испуштају паре; онда се уклања на пламен на неколико тренутака. Операција се понавља док се не заврши 10 минута.

6- Оперите водом.

7- Користите закисељени етанол (хлороводонични алкохол) да бисте исправили боју. Остављено је 20 или 30 секунди.

8- Оперите дестилираном водом.

9 - контрастатирајте тако што ћете прекрити лист метилен плавим 5 минута.

10- Оперите дестилираном водом.

11- Оставите да се осуши и узорак се узме на микроскоп.

Споре су црвене боје, а бацили плави. Важно је да не удишете паре, јер су отровне и дугорочно могу бити канцерогене.

Измењена Моеллерова техника без топлоте

Хаиама и његови сарадници су 2007. створили модификацију Моеллерове технике. Они су елиминисали корак загревања боје и заменили га додавањем 2 капи површински активног средства Тергитол 7 на сваких 10 мл раствора карбол фуксин-карбола. Добијени су исти резултати.

Апликације

Обојење спора даје веома драгоцене и корисне информације за идентификацију патогена, будући да су његово присуство, облик, локација унутар бацила и способност деформације вегетативне ћелије или не, подаци који могу водити врсту укључени у одређеном жанру.

У том контексту вриједи рећи да споре могу бити округле или овалне, могу се налазити у центру или такођер у парацентралном, субминалном или терминалном положају.

Дијаграм облика и положаја ендоспора и егзоспора

Примери

- Цлостридиум диффициле формира овалну спору у терминалном положају која деформише бацил.

- Споре Цлостридиум тертиум су овалне, не деформишу бацил и налазе се на терминалном нивоу.

- Ендоспора Цлостридиум тетани је терминална и деформише бацил, дајући изглед бубњића.

- Споре Цлостридиум ботулинум, Ц. хистолитицум, Ц. нови и Ц. септицум су округле или субтерминалне овалне и деформишу бацил.

- Ендоспора Цлостридиум сорделли је смештена у централном положају, са благом деформацијом.

Конеман Е, Аллен С, Јанда В, Сцхрецкенбергер П, Винн В. (2004). Микробиолошка дијагноза. (5. изд.). Аргентина, уредништво Панамерицана СА

Референце

1. Хаиама М, Оана К, Козакаи Т, Умеда С, Фујимото Ј, Ота Х, Каваками И. Предлог поједностављене технике бојења бактеријских спора без примјене топлоте - успешна модификација Моеллерове методе. Еур Ј Мед Рес. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Сарадници Википедије Моеллер мрља. Википедија, Слободна енциклопедија. 3. новембар 2018, 03:28 УТЦ. Доступно на: ен.википедиа.орг
3. Перез Р, Јуарез М, Родригуез (2011). Приручник за микробиолошке технике. Одељење за основне науке Микробиолошка академија. Национални политехнички институт.
4. "Ендоспоре." Википедија, Слободна енциклопедија. 25 фебруар 2018, 10:20 УТЦ 10. јануар 2019, 02:42: ен.википедиа.орг
5. Силва Л, Силва Ц, Фернандез Н, Буено Ц, Торрес Ј, Рицо М, Мациас Ј и сарадници. (2006). Радно особље аутономне заједнице Ектремадура. Специфични дневни ред Том ИВ. Редакција МАД. Севиља-Шпанија, стр. 211-212.
6. Силва М, Гарциа М, Цорралес Ј, Понце Е. (2006), специјалиста лабораторијских техничара, Галицијска здравствена служба (СЕРГАС). Обим специфичног дневног реда теме 2. Редакција МАД. Севиља-Шпанија, стр. 79-80.
7. Конеман Е, Аллен С, Јанда В, Сцхрецкенбергер П, Винн В. (2004). Микробиолошка дијагноза. (5. изд.). Аргентина, уредништво Панамерицана СА
8. Форбес Б, Сахм Д, Веиссфелд А. 2009. Микробиолошка дијагностика Баилеи & Сцотт. 12 ед. Аргентина. Редакција Панамерицана СА