МРЉЕ ОД ГРАМА: ОБРАЗЛОЖЕЊЕ, МАТЕРИЈАЛИ, ТЕХНИКА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЈА - 2025

Грам мрља је најједноставнији и најкориснији бојење техника у дијагностици микробиологије. Ову технику је створио дански лекар Ханс Цхристиан Грам 1884. године, који је успео да класификује бактерије као Грам позитивне и Грам негативне, према саставу ћелијске стијенке.

Техника је претрпела одређене модификације Хуцкера 1921. ради стабилизације реагенаса и побољшања квалитета бојења, због чега је мрља по Граму позната и као Грам-Хуцкер.

Различити размази мрље по Граму. А. Грам позитивни коки. Б. Грам негативне шипке. Ц. Грам-позитивне, полиморфонуклеарне и мононуклеарне бациле. Д. Квасци.

Овом техником такође је могуће посматрати облик микроорганизама, односно, ако су то коци, бацили, кокобацили, плеоморфни, нитасти, између осталог. Као и њихова дистрибуција у простору: у кластеру, у ланцу, изоловано, у паровима, у тетрадама итд.

Када се сумња на бактеријску инфекцију, већину примљених узорака треба мазати на тобоган и обојати Грам за микроскопско испитивање.

Грам-ов извештај упутит ће лекара о томе какав тип микроорганизма може бити узрок инфекције, пре него што добије коначни резултат културе.

У неким случајевима живот пацијента је веома угрожен, па лекарима хитно треба извештај по Граму да се постави емпиријски третман, док чекају на идентификацију микроорганизма.

На пример, ако Грам открије да у цереброспиналној течности постоје грам позитивне коке, лекар ће упутити почетну терапију антибиотицима који елиминишу ову врсту бактерија, у складу са протоколима утврђеним за то.

Једном када дође до коначног резултата са називом изолованог микроорганизма и његовог одговарајућег антибиограма, лекар ће проценити да ли ће или не променити терапију. Ова одлука ће бити донета на основу студије о осетљивости микроорганизма на антибиотике које он прима и еволуције пацијента.

Основе

Ово је техника која има 4 основна корака: бојење, фиксација метлом, уклањање боје и контраста. Због тога ова техника поред бојања бактерија омогућава и њихово разликовање.

Кристална љубичица је прво употребљено бојило. Има афинитет за пептидогликан и обојат ће све бактерије које су присутне љубичасто, након тога се ставља лугол, који делује као мордант, односно индукује стварање нерастворљивих кристалних комплекса љубичастог јода - рибонуклеарних протеина унутар ћелије. .

Грам позитивне бактерије, које имају дебели зид пептидогликана, формирају више комплекса (кристално љубичасти јод), па задржавају боју.

Поред тога, такође утиче на то да на зид Грам позитивних бактерија садржи већу количину незасићених киселина, које показују велики афинитет према оксидантима (Лугол).

У међувремену, грам-негативне бактерије имају танки слој пептидогликана, због чега бактерије формирају мање комплексе од грам-позитивних.

Затим долази корак уклањања боје, где се грам-позитивне и грам негативне бактерије понашају различито.

Грам негативне бактерије садрже спољну мембрану богату липополисахаридима који су део њихове ћелијске стијенке. Масти се уништавају контактом са ацетонским алкохолом, тако да се спољна мембрана дестабилизује, ослобађајући љубичасти кристал.

Овако се супротставља сафранину или основном фуксини, постајући црвеном.

У случају грам-позитивних бактерија, отпорне су на изблиједјивање јер избјељивач дјелује затварајући поре, спречавајући кристално љубичасти / јодни комплекс да исцури ван.

Стога, обојење кристалном љубичицом остаје стабилно и нема места за сафранин или фуксин. Због тога ове бактерије мрље тамно плаву или љубичасту боју.

материјали

Грамов сет за бојење састоји се од:

• Љубичаста стакла
• Лугол
• Ацетон алкохол
• Сафранин или основни фуксин

Припрема боја и реагенса

Кристално раствор љубичице

Решење за:

Љубичасти кристал ------------- 2 гр

Етилни алкохол 95% ----------- 20цц

Решење Б:

Амонијум оксалат ----------- 0,8 гр

Дестилована вода ------------- 80 цц

За крајњу припрему кристалне љубичице, раствор А мора бити разблажен 1:10 дестилованом водом и помешан са 4 дела раствора Б. Смеша се чува 24 сата пре употребе. Филтрирајте у амбре-боцу помоћу филтрирног папира.

Количина која се дневно користи пребацује се у боцу са капаљком ћилибара.

Иодо-Лугол

Одмерите и измерите назначену количину сваког једињења, као што следи:

Јодни кристали ------------- 1гр

Калијум јодид ------------- 2гр

Дестилована вода ------------- 300 цц

Калијум јодид се раствара мало по мало у води, а затим се додаје јод. Раствор је бријан у амбре-боцу.

Количина која се свакодневно користи преноси се капаљком у мању боцу ћилибара.

Избељивање

95% етилног алкохола -----------– 50 мл

Ацетон ------------------ 50 мл

Припрема се у једнаким деловима. Добро покријте, јер обично испарава.

Ставите у боцу са капаљком.

Овај препарат омогућава промену боје у умереном времену 5-10 секунди и највише се препоручује.

Почетници радије користе само 95% етилног алкохола, где је блеђење спорије од 10 до 30 сек.

Док искуснији могу користити чисти ацетон, при чему се боја брзо појављује од 1 до 5 сек.

Контраст

Сафранин Стоцк Солутион

Сафранина -------------– 2,5 гр

Етилни алкохол 95% --------– 100 цц

После одмеравања наведене количине сафранина, раствори се у 100 мл 95% етил-алкохола.

Радни раствор сафранина припрема се из матичног раствора.

Да бисте то учинили, измерите 10 цц основног раствора, додајте 90 цц дестиловане воде да бисте направили 100 мл.

Препоручује се да количину која се користи свакодневно пребацује у амбре боцу капалицом.

Микроорганизми који слабо мрље по Граму-Хуцкеровој мрљи, попут одређених анаероба, Легионелла сп, Цампилобацтер сп и Бруцелла сп, могу се много боље обојати користећи Копелоффову модификацију Грам-Хуцкер мрље, назива се Грам-Копелофф мрља.

Овом техником се боја сафранина мења у основни фуксин. Овом модификацијом могуће је ефикасно обојити горе наведене микроорганизме.

Складиштење реагенса

Припремљена боја треба чувати на собној температури.

Припрема размаза узорка који ће се обојати

Узорак мора да садржи најмање 10 ⁵ микроорганизама пре него што је вероватно посматрање микроорганизма у брису. Размази се могу направити из директног узорка или из културе у чврстом или течном медијуму.

Мрље би требале бити уједначене, добро распоређене и не превише густе, за бољу визуализацију присутних структура.

-Граме директних узорака

Грам нецентрификованог урина

Урин је помешан и 10 ул стављено на слајд. Посматрање најмање једне бактерије / уљног поља указује да постоји инфекција.

То значи да ће култура имати око више од 100 000 ЦФУ / мл (10 ⁵ ЦФУ / мЛ) урина у 85% случајева.

Ова метода није корисна за број колонија испод 100.000 ЦФУ.

ЦСФ Грам

ЦСФ треба центрифугирати, супернатант уклонити, а пелет ширити на тобоган. Ова течност је стерилна у нормалним условима; посматрање бактерија указује на инфекцију.

Грам респираторних узорака

Испирање испљувака, бронхија или бронхоалвеолара Грам, иако може постојати низ микроорганизама, увек ће водити дијагнозу, осим што ће бити корисна врста ћелија које се посматрају.

У случају испљувка, потребно је размаз припремити са најгуративнијим деловима узорка.

Грам столице

Не препоручује се извођење Грама на овој врсти узорака, јер нема дијагностичку вредност.

-Граме усева

Могу се направити на два начина, један из течних култура и други из чврстих култура.

Течне културе

Из течних култура је крајње једноставно; Неколико печења замућеног бујона узима се испод пламеника и ставља се на чист и сув тобоган, правећи кружне покрете од центра према ободу, како би се материјал равномерно распоредио.

Оставите да се спонтано осуши на ваздуху. Једном када се осуши, материјал се помоћу топлине фиксира на лим. Да бисте то учинили, уз помоћ пинцете, лист се пропушта 3 до 4 пута кроз пламен горионика Бунсен, пазећи да материјал не изгори.

Пусти се да се охлади и постави на мост за бојење.

Чврсти усеви

Да бисте извршили брис на Грам мрљу из чврсте културе, поступите на следећи начин:

Пре него што одаберете колоније које ће се узимати, тобоган се припрема, стављајући отприлике две капи стерилног физиолошког физиолошког раствора.

Ако оригинална плоча са културом садржи неколико различитих типова колонија, за сваку од њих биће изабрана изолована колонија. Свака колонија ће бити узета са платинастом петљом да се раствара у физиолошком раствору који је претходно стављен на слајд.

Кружни покрети су направљени од центра према периферији, како би се хомогено распоредила колонија на клизачу.

Оставите да се спонтано осуши на ваздуху. Једном када се осуши, лист се учвршћује топлином, као што је претходно објашњено (упаљачем клизача упаљачем), водећи рачуна да материјал не изгоре.

Овај поступак се мора обавити са сваком различитом врстом колоније. На комаду папира треба навести редослед онога што се примећује, на пример:

Колонија 1: Бета-хемолитичка жута колонија: У групама су примећене грам-позитивне коке

Колонија 2: Колонија крем боје, без хемолизе: Примећени су грам негативни кокобацили.

Сваки слајд мора бити означен како бисмо знали шта посматрамо.

Техника

Техника бојења по Граму је изузетно лака за извођење и релативно јефтина и не може се пропустити у микробиолошкој лабораторији.

Изводи се на следећи начин:

1. Поправите мрљу топлином и ставите је на мост за бојење.
2. Клизач прекријте потпуно кристалном љубичицом 1 минут.
3. Исперите водом Не сушити
4. Прекријте лист отопином лугола, оставите да делује 1 минут. Исперите водом Не сушити.
5. Избелите 5-10 секунди уз лагано мућкање у алкохолном ацетону. Или поставите лим у вертикални положај и на површину капљите капи средства за уклањање оболелог средства док се не уклони сувишни остатак љубичастог стакла. Не прелазе.
6. Исперите водом Не сушити.
7. Замените клизач на мосту и обложите га 30 секунди сафранином (Грам-Хуцкер) или 1 мин основним фуксином (Грам-Копелофф).
8. Оперите водом
9. Пустите да се спонтано осуши у усправном положају.

Једном када се осуши, ставите 1 кап потопног уља да бисте је посматрали испод циља 100Кс у светлосном микроскопу.

Корисност

Ова техника омогућава разликовање морфотинториалних разлика већине бактерија.

Кваса се такође разликује по овој боји. Узму кристално љубичасту, односно мрљу по Граму.

С друге стране, могу се разликовати Грам-позитивни бацили који стварају споре, у којима се види јасан простор унутар бацила, где се формирао ендоспор, иако споре не мрље добро. Остале технике као што је Схаеффер-Фултон користе се за бојење спора.

Треба напоменути да се ово обојење не користи за обојење свих врста бактерија, то јест, постоје случајеви у којима бојење не делује.

У овом случају могу се поменути бактерије којима недостаје ћелијска стијенка. На пример: род микоплазме, сферопласти, уреаплазма, Л-облици и протопласти.

Такође мрље врло лоше бактерије са зидовима богатим миколичним киселинама, као што су микобактерије, и унутарћелијским бактеријама, као што су Цхламидиас и Рицкеттсиас.

Такође је неефикасна у бојењу већине спирохеталних бактерија.

Постоје бактерије истог рода које могу да се примете на истом узорку као и грам-грам и грам негативан. Када се то догоди назива се променљивом Грам флеком, која може бити последица промене хранљивих материја, температуре, пХ или концентрације електролита.

Заједничке грешке

Претјерано избјељивање

Претјеривање у кораку промјене боје може довести до посматрања лажних Грам негативних микроорганизама.

Не чека се довољно дуго сушење да се дода уље за урањање

Може проузроковати да Грам позитивне бактерије обоје Грам негативне (лажни Грам негативне). То се дешава зато што у старим културама вероватно има мртвих или покварених бактерија и под тим условима бактерије не задржавају кристално љубичасту.

Користите веома стари раствор лугола:

Временом лугол губи својства и боја му бледи. Ако се користи већ дегенерирани реагенс, он неће добро фиксирати кристално љубичасту, па постоји могућност добијања визуализације лажно грам негативних микроорганизама.

Плава позадина

Правилно обојена позадина ће бити црвена. Плава позадина указује на то да је дисколорација била недовољна.

Референце

1. Риан КЈ, Раи Ц. 2010. Схеррис. Медицинска микробиологија, 6. издање МцГрав-Хилл, Њујорк, САД
2. Конеман Е, Аллен С, Јанда В, Сцхрецкенбергер П, Винн В. (2004). Микробиолошка дијагноза. (5. изд.). Аргентина, уредништво Панамерицана СА
3. Форбес Б, Сахм Д, Веиссфелд А. 2009. Микробиолошка дијагностика Баилеи & Сцотт. 12 ед. Аргентина. Редакција Панамерицана СА
4. Цасас-Ринцон Г. 1994. Општа микологија. Друго издање Централног универзитета у Венецуели, издања библиотека. Венезуела Царацас.
5. "Мрља од грама." Википедија, Слободна енциклопедија. 4 окт 2018, 23:40 УТЦ. 9 децембар 2018, 17:11 Преузето са ес.википедиа.орг.
6. Гонзалез М, Гонзалез Н. 2011. Приручник медицинске микробиологије. Друго издање, Венецуела: Дирекција за медије и публикације Универзитета у Карабобу.
7. Лопез-Јацоме Л, Хернандез-Дуран М, Цолин-Цастро Ц, Ортега-Пена С, Церон-Гонзалез Г, Францо-Цендејас Ф. Основне мрље у микробиолошкој лабораторији. Истраживање инвалидности. 2014; 3 (1): 10-18.