ЗИЕХЛ-НЕЕЛСЕН МРЉА: ОБРАЗЛОЖЕЊЕ, РЕАГЕНСИ И ТЕХНИКА - БИОЛОГИЈА - 2025

Зиехл-Неелсен бојење техника за идентификацију микроорганизама отпоран алкохола киселина (АРА). Назив овог микробиолошког поступка односи се на његове ауторе: бактериолог Франз Зиехл и патолог Фриедрицх Неелсен.

Ова техника је врста диференцијалног бојења, која укључује употребу различитих боја како би се створио контраст између структура које желите да посматрате, разликујете и касније идентификујете. Зиехл-Неелсен мрља се користи за идентификацију одређених врста микроорганизама.

Зиехл-Неелсен мрља

Неки од ових организама су микобактерије (нпр. Мицобацтериум туберцулосис), нокардија (нпр. Ноцардиа сп.) И неки једноцелични паразити (нпр. Цриптоспоридиум парвум). Много бактерија се може класификовати кроз уобичајену технику која се назива мрља по Граму.

Међутим, неким бактеријским групама су потребне и друге методе да би их могли идентификовати. Технике попут мрље Зиехл-Неелсен захтијевају комбинације боја са топлином да би се фиксирале на ћелијски зид.

Затим долази процес избељивања који омогућава два резултата: отпорност или осетљивост на промену боје киселинама и алкохолима.

Основе

Образложење ове технике бојења заснива се на својствима ћелијске стијенке ових микроорганизама. Зид је сачињен од врсте масних киселина које се називају миколичне киселине; За њих је карактеристично да имају веома дуге ланце.

Кад масне киселине имају веома дугу структуру, оне лакше задржавају боје. Неке бактеријске родове је врло тешко обојати по Граму, због високог садржаја миколичних киселина у ћелијској стијенци.

Зиехл-Неелсен мрља користи фенолно једињење карбол фуксин, основну мрљу. То има способност интеракције са масним киселинама ћелијског зида, који је воштане текстуре на собној температури.

Бојење карболним фуксином појачава се у присуству топлоте, јер се восак растопи и молекули боје брже се крећу у ћелијску стијенку.

Киселина која се касније користи служи за уклањање обојених ћелија које нису обојене јер њихов зид није био довољно повезан са бојом; према томе, јачина киселог избељивача може уклонити кисело бојило. Ћелије које одолијевају овој боји боје називају се брзим киселинама.

Секундарна боја

Након деколоризације узорка, он је у супротности са другом бојом која се зове секундарна боја. Генерално се користи метилен плаво или малахит зелено.

Секундарна боја обоји позадински материјал и последично ствара контраст структурама обојеним у првом кораку. Само обојене ћелије апсорбују другу боју (контраста) и попримају њихову боју, док ћелије које брзо луче киселину задржавају своју црвену боју.

Овај поступак се често користи за идентификацију Мицобацтериум туберцулосис и Мицобацтериум лепрае, који се називају бацилима брзим киселинама.

Реагенси

Примарна боја

Користи се 0,3% карбол фуксин (филтриран). Ова боја се припрема од мешавине алкохола: фенола у етанолу (90%) или метанолу (95%), а у овој мешавини је растворено 3 грама основног фуксина.

Раствор за бељење

У овом кораку могу се користити раствори 3% алкохолне киселине или 25% сумпорне киселине.

Секундарна боја (контра-боја)

Боја која се највише користи за контрастирање узорака је обично 0,3% метилен плава. Међутим, могу се користити и друге, попут 0,5% малахит зелене боје.

Техника

Поступак брзог бојења у киселинама

Припремите бактеријски размаз

Ова припрема се врши на чистом, сувом тобогану, поштујући мере опреза стерилности.

Сушење размаза

Оставите да се суха суши на собној температури.

Загрејати узорак

Узорак треба загрејати подметањем ватре на слајд испод. Фиксација алкохола може се извршити ако брис није припремљен испљувак (третиран натријум-хипохлоритом да би га избелио) и ако се неће одмах обојити.

М. туберкулоза се уклања белилом и током процеса бојења. Топлотна фиксација необрађеног спутума неће убити М. туберцулосис, док је фиксација алкохола бактерицидна.

Покријте мрљу

Мрља је прекривена раствором карболног фуксина (примарна основна мрља).

Загрејте мрљу

То се ради за 5 минута. Требали бисте примјетити еволуцију паре (приближно 60 ° Ц). Важно је да се не прегреје и да се избегне спаљивање узорка.

Што се тиче загревања мрље, треба бити веома опрезан приликом загревања карболног фуксина, посебно ако се бојење врши на пладњу или другој посуди у којој су сакупљене лако запаљиве хемикалије из претходног бојења.

Под тобоганима треба подметнути само мали пламен помоћу претходно упаљеног бриса навлаженог с неколико капи киселог алкохола, метанола или 70% етанола. Избегавајте употребу великог бриса натопљеног у етанолу јер то представља опасност од пожара.

Оперите мрљу

Ово прање мора да се уради чистом водом. Ако вода из славине није чиста, очистите мрљу филтрираном или дестилованом водом, најбоље.

Облог премажите киселим алкохолом

Овај кисели алкохол треба да буде 3%. Покривање се врши 5 минута или док се мрља не промени довољно, тј. Бледо ружичасте боје.

Мора се узети у обзир да је кисели алкохол запаљив; стога се мора користити с великом пажњом. Избегавајте да се не налазите у близини извора паљења.

Оперите мрљу

Прање треба да буде чистом дестилованом водом.

Прекријте мрљу мрљом

То може бити малахитно зелена (0,5%) или метилен плава (0,3%) мрља од 1 до 2 минута, користећи дуже време ако је мрља танка.

Оперите мрљу

Опет треба користити чисту (дестиловану) воду.

За одвод

Стражњу страну клизача треба очистити, а мрљу ставити на одводну полицу да се осуши на ваздуху (немојте користити упијајући папир за сушење).

Испитајте брис под микроскопом

Морају се користити 100Кс објективно и потопно уље. Систематично скенирајте брис и забиљежите релевантна запажања.

Протумачите резултате

Теоретски, микроорганизми који мрљају црвенкасту боју сматрају се позитивном киселином (ААР +).

Супротно томе, ако се микроорганизми обоје у плаву или зелену боју, зависно од боје која се користи као контра-боја, сматрају се негативним негативним киселинама (ААР-).

Референце

1. Апурба, С. и Сандхиа, Б. (2016). Основе практичне микробиологије (1. изд.). Јаипее Бротхерс Медицал Публисхерс.
2. Бауман, Р. (2014). Микробиологија са болестима по телесном систему (4. изд.). Пеарсон Едуцатион, Инц.
3. Херитаге, Ј., Еванс, Е. и Киллингтон, А. (1996). Уводна микробиологија (1. изд.). Цамбридге Университи Пресс.
4. Морелло, Ј., Гранато, П. Вилсон, М. и Мортон, В. (2006). Лабораторијски приручник и радна свеска из микробиологије: Примене на негу пацијената (11. изд.). МцГрав-Хилл образовање.
5. Васантхакумари, Р. (2007). Уџбеник микробиологије (1. изд.). БИ Публикације ПВТ.