АГАР МРС: ОСНОВА, ПРИПРЕМА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЈА - 2025

Агар ОСП је селективни култура чврста медиј користи за изолацију и бројање киселине бактерија млечне, посебно рода Лацтобациллус. Овај агар су 1960. године створили Ман, Рогоса и Схарпе, а носили су исти назив, али због његове сложености често се користи скраћеница МРС.

Састоји се од протеозног пептона, екстракта меса, екстракта квасца, глукозе, сорбитан монолеата, дикалијум-фосфата, натријум-ацетата, амонијум-цитрата, магнезијум-сулфата, мангановог сулфата и агарја.

Ман Рогоса и Схарпе Агар (МРС) семенкивани са Лацтобациллус сп. Извор: Фотографију за овај чланак донирали аутори: Баез Е, Гонзалез Г, Хернандез Г, Лопез Е, Мега М. Фотографија снимљена током истраге под називом: Процена бактерија млечне киселине и бифидобактерија са пробиотским потенцијалом у мајчином млеку и столици за новорођенчад .

Ова композиција омогућава правилан развој бактерија млечне киселине из клиничких узорака, као што су измет, вагинални исцедак, орални узорци и мајчино млеко, као и млечна и месна храна.

Не користи се рутински у клиничким лабораторијама, јер су бактерије млечне киселине ретко укључене у процесе болести. Међутим, у области микробиологије хране, употреба МРС-агара је чешћа.

С друге стране, овај медијум користе неки истраживачки центри чији је циљ проучавање бактерија млечне киселине.

Основе

Ман, Рогоса и Схарпе агар има прилично сложен састав. Разбијањем функције сваке његове компоненте може се објаснити њен темељ.

Протеински пептон, екстракт меса, екстракт квасца и глукоза су хранљиве материје које обезбеђују извор угљеника, азота, витамина и минерала неопходних за раст бактерија. Поред тога, глукоза је универзални извор енергије који се користи у већини култура.

Са друге стране, да би се фаворизовао раст бактерија млечне киселине, неопходно је присуство кофактора (катиона) неопходних у метаболизму лактобацила и сродних бактерија; Ова једињења су натријумске, магнезијумове и манганове соли.

Слично томе, сорбитан монолеат или полисорбат 80 су важан извор масних киселина, јер се апсорбују као храњиве материје.

Даље, сорбитан монолеат и амонијум-цитрат делују инхибирајући развој пратеће флоре, посебно грам негативне бактерије, обезбеђујући селективни карактер овог агара.

Коначно, агар-агар је онај који даје чврсту конзистенцију медијуму.

Постоје и друге варијанте агара Ман Рогоса Схарпе; један од њих је допуњен цистеином (МРСц), веома користан за изоловање бифидобактерија, између осталих микроорганизама. С друге стране, постоји МРС медијум допуњен неомицином, паромомицином, налидиксичном киселином и литијум хлоридом, посебан за селективно бројање бифидобактерија у млечним производима.

Припрема

Извагати 68,25 грама дехидрираног медијума и растворити у литру дестиловане воде. Оставите да стоји 5 минута. Да се ​​потпуно отопи, окрените се извору топлоте, често мешајући, и кухајте 1 до 2 минута. Стерилизирајте у аутоклаву на 121 ° Ц током 15 минута.

Када напуштате аутоклав, оставите да одстоји неколико минута и распоредите је док је још вруће у стерилним Петријевим посудама.

Оставите да се очврсну и преокрену плоче, нарежите у плочице и ставите у хладњак до употребе. Оставите плоче да се загреју на собну температуру пре употребе.

ПХ медијума треба да буде 6,4 ± 0,2. Неке комерцијалне куће препоручују пХ између 5,5 и 5,9.

Дехидрирани медијум је беж боје, а припремљен је тамно јантарне боје.

И дехидрирани медијум и припремљене плоче треба чувати на 2-8 ° Ц.

Апликације

Плочице с МРС агарима могу се сејати површински (исцрпљивање или Дригалски лопатица). Може се сејати и по дубини. Плоче треба инкубиране на 37 ° Ц у мицроаеропхилицити (4% О ₂ и 5-10% ЦО ₂ ) за 24 до 72 сата.

Начин сјетве бира се према жељеној сврси (изолацији или пребројавању).

Карактеристике колонија

Претпостављене колоније лактобацилуса попримају бјелкасту боју и на овом агару имају мукоидни или кремасти изглед. Они се морају накнадно идентификовати.

Изолација бактерија млечне киселине

За то се користи површинска сетва. Узорци за посијање захтевају претходни поступак.

У случају узорака мајчиног млека, препоручује се центрифугирање 1 мл узорка при 14.000 обртаја у току 10 минута, како би се уклонио масни слој. 900 µл се одбаци, а у преосталих 100 µл седимент се суспендује и излије на површину агара МРС, који би се затим равномерно распоредио Дригалски лопатицом.

У случају узорака столице, један (1) грам столице се изваже и хомогенизује у 9 мл 0,1% стерилне воде пептона, што одговара разблажењу од 1/10. Затим се раде серијска разблажења, док се не добије коначно разређивање од 10 ^-4 .

Коначно, узме се 100 ул 10 разблаживања 10 ^-2 , 10 ^-3 и 10 ^-4 и свако разблаживање се посеје на МРС агар, равномерно се распоређујући Дригалски лопатицом.

Број бактерија млечне киселине

У овом случају сјетва се врши дубином.

За узорке мајчиног млека узима се 1 мл и смешта у стерилну конусну пластичну епрувету. МРС агар се додаје на приближној температури од 40 ° Ц до крајњег запремине од 25 мл, чиме се добија хомогена смеша. Након тога се уједначује у стерилне Петријеве посуде и остави да стоји до полимеризације.

За узорке столице раде се разблажења, као што је раније описано. Узмите 1 мл сваког разблажења и ставите га у стерилне конусне пластичне епрувете. Растопљени МРС агар је додат у запремину од 25 мЛ.

Смеша сваког разблаживања се равномерно излива у стерилну Петријеву посуду. На крају се оставља да се одмори до полимеризације.

Колоније рачунају на агар Ман Рогоса и Схарпе (МРС). Извор: Фотографија је донирана за овај чланак. Аутори: Баез Е, Гонзалез Г, Хернандез Г, Лопез Е, Мега М. Фотографија снимљена током истраживања под називом: Процена бактерија млечне киселине и бифидобактерија са пробиотичким потенцијалом у мајчином млеку и измету дојенчади.

Ниво истраживања

Сваким даном проучавање бактерија млечне киселине добија све веће интересовање; Истраживачи посебно желе да науче о новим сојевима и њиховом потенцијалу као почетним ферментима за стандардизацију у производњи млечних производа, између осталог.

У том смислу, Алварадо ет ал. (2007) користили су МРС агар за спровођење студије у којој су изоловали, идентификовали и карактерисали бактерије млечне киселине присутне у занатском венецуеланском андском димљеном сиру.

У сиру су открили присуство бактерија рода Лацтоцоццус и Лацтобациллус и закључили да су смеше изолованих сојева погодне као почетни сојеви у производњи сирева од пастеризованог млека.

Са друге стране, Санцхез и др. (2017) користи МРС агар за испитивање присутности бактерија млечне киселине у пробавном тракту прасића, како би их користили као природне пробиотике који повећавају продуктивност здравих прасади.

Помоћу овог медијума успели су да изолују четири врсте: Лацтобациллус јохнсонии, Лацтобациллус бревис, Ентероцоццус хирае и Педиоцоццус пентосацеус.

Исто тако, Баез и др. (2019) користи МРС агар за процену млечнокиселинских бактерија (ЛАБ) и бифидобактерија са пробиотским потенцијалом у мајчином млеку и измету дојенчади.

Успели су да изолују 11 БАЛ и 3 Бифидобацтериа сп у мајчином млеку, и 8 БАЛ и 2 Бифидобацтериа сп. у измету. Сви су задовољили одређене параметре који их доказују као бактерије са пробиотском активношћу.

Аутори су закључили да и мајчино млеко и измет искључиво дојене бебе служе као природни извори пробиотичких бактерија.

КА

Да би се проценио квалитет МРС агара, контролни сојеви као што су:

Лацтобациллус ферментум АТЦЦ 9338, Лацтобациллус цасеи АТЦЦ 393, Бифидобацтериум бифидум АТЦЦ 11863, Лацтобациллус плантарум МКТА 8014, Лацтобациллус лацтис МКТА 19435, Педиоцоццус дамносус МКТА 29358, Есцхерицхиа цоли и Бациллус цереи.

Очекивани резултати су задовољавајући раст за првих 6 бактерија, док Е. цоли и Бациллус цереус морају бити у потпуности инхибирани.

Референце

1. Алварадо Ц, Цхацон З, Отониел Ј, Гуерреро Б, Лопез Г. Изолација, идентификација и карактеризација бактерија млечне киселине венецуеланског димљеног андског занатског сира. Његова употреба као почетна култура. Циент. (Марацаибо) 2007; 17 (3): 301-308. Доступно на: сциело.орг.
2. Санцхез Х, Фабиан Ф, Оцхоа Г, Алфаро Изолација бактерија млечне киселине из пробавног тракта прасића. Рев. инвестига. ветеринар. Перу 2017; 28 (3): 730-736. Доступно на: сциело.орг.
3. Баез Е, Гонзалез Г, Хернандез Г, Лопез Е, Мега М. Процена бактерија млечне киселине и бифидобактерија са пробиотским потенцијалом у мајчином млеку и измету новорођенчади у општини Ацеведо, Миранда 2017. Преддипломски рад за стицање дипломе првоступника Биоанализа. Универзитет у Карабобу, Венецуела.
4. Британниа Лаборатори. МРС агар. 2015. Доступно на: британиалаб.цом
5. Сарадници Википедије МРС агар. Википедија, Слободна енциклопедија. 10. јануар 2018, 19:44 УТЦ. Доступно на: википедиа.орг Приступљено 17. фебруара 2019. године.
6. Рои Д. Медији за изоловање и набрајање бифидобактерија у млечним производима. Инт Ј Фоод Мицробиол, 200128; 69 (3): 167-82.