ДАПИ (4 ', 6-ДИАМИДИНО-2-ФЕНИЛИНДОЛ): КАРАКТЕРИСТИКЕ, ОБРАЗЛОЖЕЊЕ, УПОТРЕБА - ХЕМИЈА - 2025

ДАПИ (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) је боја флуоресцентном имовине служи као као маркер, широку примену у техници флуоресцентном микроскопијом или проточне цитометрије, између осталих. Флуоресценција коју емитира је јарко плаве боје, а њено побуђење се јавља између 455-461 нм (УВ светлост).

ДАПИ боја може проћи кроз ћелијску мембрану мртвих ћелија са великом лакоћом. Такође може да обоји језгре живих ћелија, али у овом случају концентрација ове мора бити већа.

Хемијска структура флуоресцентног бојила ДАПИ. Извор: Слика: Датотека: ДАПИ.свг је векторска верзија ове датотеке. Треба га користити уместо ове растерске слике када није инфериорнији / Рицхард Вхеелер (Зепхирис) Уређена слика

Боја је у могућности да приступи ћелијској ДНК за коју има посебан афинитет, са великом страшћу везује се за азотне базе аденин и тимин. Из тог разлога је веома корисна у неким техникама молекуларне биологије.

Ово једињење припада групи индолских боја и показало се да има већу осетљивост на ДНК од етијум-бромида и пропидијум-јодида, нарочито на агарозне гелове.

Употреба ове флуоресцентне боје је веома широка, јер је корисна за: проучавање промена у ДНК у апоптотичким процесима (ћелијска смрт) и стога откривање ћелија у овом процесу; за ДНК фотографије (отисак ДНК фотографија); да проучи бактеријску контаминацију; или за визуелизацију нуклеарне сегментације.

Такође се користи у истраживању хромосомских трака, у детекцији Мицопласмас сп ДНА, у интеракцији ДНК-протеина, у бојењу и бројању ћелија имунофлуоресценцијом, па чак и у боји зрелих полена зрна.

карактеристике

ДАПИ је скраћеница од његовог хемијског назива (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол). Његова молекуларна формула је Ц ₁₆ Х ₁₅ Н _5. Она има молекулску тежину 350.3. У близини распона УВ светлости (345 до 358 нм) долази до максималног побуђења комплекса ДАПИ-ДНК, док се максимална емисија флуоресценције догађа између 455-461 нм.

Ова боја се карактерише као жути прах, али структуре обележене овим флуорофором емитују сјајно плаво светло.

Међутим, то је једињење растворљиво у води, али како би се убрзало његово растварање може се применити мало топлоте. Може се разблажити са ПБС-ом, али не директно у њему.

Једном када се боја припреми, мора се чувати у мраку, односно заштићено од светлости, на температури од 2 до 8 ° Ц (у фрижидеру). Под овим условима, боја је стабилна дуже од 3 недеље или месеци.

Ако је заштићен од светлости, али остављен на собној температури, његова стабилност опада на 2 или 3 недеље, али изложена директном светлу, пропадање је врло брзо. Ако желите да чувате много дуже, можете га хладити на -20 ° Ц, подељене у аликвотама.

Основе

Бојење се заснива на стварању нуклеарне контраста у главним техникама молекуларне биологије, као што су: проточна цитометрија, флуоресцентна микроскопија и бојење метафазних хромозома или интерфазних језгара, између осталог.

Ова техника се заснива на великом афинитету боје који има душичне базе (аденин и тимин) садржане у генетском материјалу (ДНК) у мањој бразди. Док је на цитоплазматском нивоу, она оставља врло мало позадине.

Када се флуоресцентна боја везује за аденинске и тиминске дијелове ДНК, флуоресценција се значајно повећава (20 пута више). Боја коју емитује је јарко плава. Значајно је да не постоји емисија флуоресценције када се веже на ГЦ (гванин-цитозин) парове база.

Важно је напоменути да иако има афинитет према РНА, то не прави проблем, јер се највећи степен емисије енергије из овог молекула догађа на другој таласној дужини (500 нм), за разлику од ДНК, који то чини на 460 нм. Поред тога, пораст флуоресценције једном везане за РНА износи само 20%.

ДАПИ се користи више за бојење мртвих (фиксних) ћелија него живих ћелија, јер је за обојење следећих потребно много веће концентрације бојила, то је зато што је ћелијска мембрана много мање пропусна за ДАПИ када је жива.

ДАПИ боја може се користити у комбинацији са црвеним и зеленим флуорофорима за вишебојно искуство.

Употреба

ДАПИ (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) је одличан флуорофор и зато се широко користи у различитим техникама и у различите сврхе. Следеће објашњава употребу ДАПИ у главним техникама.

Проточна цитометрија

Истраживачи Гохде, Сцхуманн и Занте 1978. године први су користили и предложили ДАПИ као флуорофор у техници проточне цитометрије, који су имали велики успех због високе осетљивости на ДНК и великог интензитета у емисији флуоресценције.

Употреба ДАПИ у овој техници омогућава проучавање ћелијског циклуса, квантификацију ћелија и обојење живих и мртвих ћелија.

Иако постоје и друга бојила, попут етидијум-бромида, Хоецхст-оксида, акридин наранџе и пропидијум-јодида, ДАПИ је један од најчешће коришћених јер је фотостабилнији од претходно поменутих.

За ову технику потребно је поправити ћелије, за то се може користити апсолутни етанол или 4% параформалдехид. Узорак је центрифугиран, а супернатант је одбачен, након чега ћелије хидрирају додавањем 5 мл ПБС пуфера током 15 минута.

Док време пролази, припремите ДАПИ мрљу са пуфером за бојење (ФОКСП3 од БиоЛегенд) у концентрацији од 3 уМ.

Центрифугирајте узорак, одбаците супернатант, а затим прекријте 1 мл раствора ДАПИ током 15 минута на собној температури.

Узорак однесите у проточни цитометар одговарајућим ласером.

Протицајна микрофлуорометрија

Друга техника у којој се користи ДАПИ је проточна микро-флуорометрија заједно са другим флуорофором који се назива митрамицин. Обе су корисне за појединачно квантификацију ДНК хлоропласта, али ДАПИ је најприкладнији за мерење Т4 честица бактериофага.

Хибридизација

Овом техником се у основи користе ДНК пробе означене флуоресцентним бојама које могу бити ДАПИ.

Узорак захтева термичку обраду да би се денатурирала дволанчана ДНК и претворила у два једноланчана ланца. После тога се хибридизира са ДАПИ денатурираном ДНК сондом која има секвенцу од интереса.

Касније се испере да би се елиминисало оно што није хибридизирано, користи се контраст за визуализацију ДНК. Флуоресцентни микроскоп омогућава посматрање хибридизиране сонде.

Ова техника има сврху откривања специфичних секвенци у хромозомској ДНК, ради постављања дијагнозе одређених болести.

Ове цито-молекуларне технике су биле од велике помоћи у одређивању детаља у проучавању кариотипа. На пример, показао је регије аденозина и тимина богата базним паровима зване хетерохроматске регије или ДАПИ опсези.

Ова техника се широко користи за проучавање хромозома и хроматина код биљака и животиња, као и за дијагнозу пренаталних и хематолошких патологија код људи.

У овој техници, препоручена концентрација ДАПИ је 150 нг / мл у времену од 15 минута.

Склопљени тобогани морају се чувати заштићени од светлости на 2-8 ° Ц.

Имунофлуоресцентно бојење

Ћелије су фиксиране 4% параформалдехидом. Ако се користе друге мрље, ДАПИ се на крају оставља као контраста, а ћелије су прекривене раствором ПБС током 15 минута. Док време прође, припремите раствор ДАПИ разблаживањем са ПБС-ом, тако да крајња концентрација износи 300 уМ.

Тада се вишак ПБС-а уклања и прекрива ДАПИ током 5 минута. Прати неколико пута. Клизач се прегледава под флуоресцентним микроскопом под одговарајућим филтером.

Сигурносни лист

Са овим једињењем се мора поступати пажљиво, јер је једињење које има мутагена својства. Активирани угљен се користи за елиминацију овог једињења из водених раствора које треба одбацити.

Рукавице, хаљина и заштитне наочаре морају се користити да се избегну незгоде са овим реагенсом. Ако дође до контакта с кожом или слузницом, подручје треба испрати с довољно воде.

Никада не бисте требали да пипетирате овај уста уста, користите пипете.

Не контаминирајте реагенс микробним агенсима јер ће то довести до погрешних резултата.

Не разблажавајте ДАПИ мрљу више него што је препоручено, јер ће то значајно смањити квалитет мрље.

Немојте излагати реагенс директном светлу или држати топло јер то смањује флуоресценцију.

Референце

1. Браммер С, Тониаззо Ц и Поерсцх Л. Цорантес обично укључени у цитогенетику биљака. Арк. Инст. Биол. 2015, 82. Доступно од: сциело.
2. Импатх Лабораториес. ДАПИ. Доступно на: менаринидиагностицс.цом/
3. Цитоцелл Лабораториес. 2019. Упутство за употребу ДАПИ-ја. доступно на цитоцелл.цом
4. Елосеги А, Сабатер С. Појмови и технике у речној екологији. (2009). Редакција Рубес, Шпанија. Доступно на: боокс.гоогле.цо.ве/
5. Новаес Р, Пенитенте А, Талвани А, Натали А, Невес Ц, Малдонадо И. Примена флуоресценције у модификованој дисекторској методи за процену броја миоцита у срчаном ткиву. Арцх Брас. Кардиол. 2012; 98 (3): 252-258. Доступно од: сциело.
6. Ројас-Мартинез Р, Завалета-Мезија Е, Ривас-Валенсија П. Присуство фитоплазми у папаји (Царица папаиа) у Мексику. Цхапинго Магазине. Серија о хортикултури, 2011; 17 (1), 47-50. Доступно на: сциело.орг.