ИМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЈА: ОБРАЗЛОЖЕЊЕ, ПРОТОКОЛ И АПЛИКАЦИЈЕ - БИОЛОГИЈА - 2025

Иммунофлуоресценце је моћна техника имунолошког бојења коришћењем антитела ковалентно везан за флуоресцентне молекуле да идентификују специфичне циљеве у ћелијским узорцима фиксне на чврстој подлози.

Ова техника укључује микроскопско посматрање са имунолошком специфичношћу, омогућавајући посматрање живих или мртвих ћелија које могу представљати незнатне количине антигена. Широко се користи како у пољу истраживања, тако и у клиничкој дијагностици различитих патологија.

Имуно обележавање актинских филамената у ћелијама кардиомиоцита (Извор: Пс1415 преко Викимедиа Цоммонс)

Ова техника, углавном квалитативна (са неким квантитативним варијантама), односи се посебно на визуелизацију узорка флуоресцентним сигналом производа, који је флуоресцентни молекул везан за антитело и који може бити побуђен на одређеној таласној дужини. .

У ћелијском контексту је веома корисно проучити присуство / одсуство и субцелијску локацију протеина. Техника је у почетку коришћена у клиничким окружењима за дијагнозу вируса попут грипа, а потом и за многе друге заразне болести.

То је веома осетљива техника и уз одговарајућу опрему за микроскопију може да има врло добру резолуцију. За његово посматрање је потребна употреба конфокалних или епифлуоресцентних микроскопа.

Међутим, иако је веома популаран, може представљати неке важне проблеме у вези са добијањем неспецифичне флуоресценције која ствара одређену „буку“ у позадини, што често ограничава адекватно очитавање резултата.

Основе

Имунофлуоресценција је заснована на искоришћавању биолошког феномена реакције интеракције између антитела и антигена. То се посебно односи на визуелизацију или детекцију ове реакције узбудљивим флуоресцентним молекулама до одређене таласне дужине.

Антитело је протеин имуноглобулина који се излучује из активних Б ћелија, који се посебно ствара против антигена, на који се може везати са високим афинитетом и специфичношћу. Имунофлуоресценција користи ИгГ имуноглобулине који су растворљиви у крвном серуму.

Антитела су молекуле до 950 кДа сачињене од два кратка (лака) и два дугачка „И“ облика (тешка) пептидна ланца. Лаки и тешки ланци су подељени у две домене: једна променљива, способна да препозна антиген, а друга константна или очувана, карактеристична за сваку врсту.

Антигени су функционално дефинисани као молекули које антитело може препознати и највећим делом су протеини. Када је животиња изложена антигену, лимфоцити имунолошког система се активирају, производећи специфична антитела против њега и то функционишу као одбрамбени систем.

Антиген, као што је протеин, на пример, може имати више од једног епитопа или места препознавања антителом, тако да серум животиње који је изложен антигену може имати поликлонална антитела против различитих региона истог протеина.

Имунофлуоресценција, дакле, користи способност животиње да производи поликлонална антитела против одређеног антигена да би је прочистила и потом користила за детекцију истог антигена у другим контекстима.

Међу флуоресцентним бојама или молекулима који се највише користе у неким имунофлуоресцентним техникама су флуоресцеински изотиоцијанат (ФИТЦ), тетраметил-родамин изотиоцијанат-5 и 6 (ТРИТЦ), многи цијанини као што су Ци2, Ци3, Ци5 и Ци7 и боје назване Алека Флуор® , као што је Алека Флуор®448.

Протокол

Имунофлуоресцентни протокол варира у зависности од многих фактора, али генерално обухвата линеарни низ корака који се састоји од:

• Припрема плоча и ћелија
• Фиксација узорака
• Пермеабилизација
• Блокирање
• Имуностање или имуно обојење
• Монтажа и посматрање

-Припрема

Од узорака

Припрема узорака зависиће од њихове природе и врсте искуства која треба спровести. Најједноставнији случај, који укључује употребу ћелија у суспензији, биће објашњен у даљем тексту.

Ћелије у суспензији, то јест у течном медијуму за културу, прво се морају одвојити од ње центрифугирањем, а затим морају бити испране пуферским раствором или изосмотским „пуфером“, што чува њихов интегритет.

Обично се користи фосфат-физиолошки пуфер познат као ПБС, у коме се ћелије ресуспендују и ова мешавина се поново центрифугује да се добију ћелије без медијума за узгој, који могу да садрже ометајуће супстанце.

Оштрица

Слидеви који се користе за микроскопско посматрање, где ће се ћелије касније фиксирати за одговарајуће третмане на низводној вредности, такође морају бити пажљиво припремљени.

Они су прекривени или „сензибилисани“ раствором поли-лизина, синтетичког полимера који ће деловати као „молекуларно лепак“ између ћелија и чврстог носача, захваљујући електростатичкој интеракцији између позитивних набоја њихових амино група и ћелија. негативни набоји протеина који прекривају ћелије.

Фиксација узорака

Овај поступак се састоји од имобилизације протеина који се налазе унутар ћелије како би се очувала њихова просторна локација нетакнута. Молекули који се користе морају бити у стању да прелазе све врсте ћелијских мембрана и формирају решетке са ковалентним протеинима.

Формалдехид и параформалдехид, глутаралдехид, па чак и метанол се широко користе, са којима се ћелијски узорци инкубирају током одређеног времена, а затим исперу са изосмотским раствором пуфера.

Након фиксирања ћелија, настављају да се причвршћују на листове претходно осетљиве на поли-лизин.

Пермеабилизација

У зависности од врсте испитивања која се врши, биће потребно пермеабилизирати ћелије које се проучавају или не. Ако се тражи сазнање локације, присуства или одсуства одређеног протеина на ћелијској површини, пермеабилизација неће бити потребна.

С друге стране, ако желите знати локацију протеина унутар ћелије, пермеабилизација је од суштинског значаја и састојат ће се од инкубације узорака с Тритон Кс-100, детерџентом који може пробити ћелијске мембране.

Блокирање

Основни корак у свим имунолошким техникама је блокирање. У овој фази поступка, блокирање се састоји од прекривања на сензибилисаним листовима свих места са молекулама поли-лизина на које се ћелије нису лепиле. Односно, спречава било какву неспецифичну повезаност.

Обично се за блокирање раствора користе говеђи серумски албумин (БСА) у ПБС пуферу и најбољи резултати се добијају што је дуже време инкубације са овим раствором. Након сваког корака, укључујући блокирање, потребно је испрати преостали раствор.

Имуностање или имуно обојење

Процедура имуно-обојења или имуно-бојења зависиће углавном од тога да ли је директна или индиректна имунофлуоресценција (видети доле).

Ако је примарна или директна имунофлуоресценција, узорци ће се инкубирати са жељеним антителима, која морају бити спојена са флуоресцентним бојама. Поступак инкубације састоји се од разблаживања антитела у раствору који ће такође садржавати БСА, али у мањем пропорцији.

Када је случај секундарне или индиректне имунофлуоресценције, треба извршити две узастопне инкубације. Прво са жељеним антителима, а затим са антителама која су способна да открију константне области примарних имуноглобулина. Управо су та секундарна антитела ковалентно везана за флуорофоре.

Техника је веома свестрана, омогућава истовремено обележавање више од једног антигена по узорку, све док постоје примарна антитела повезана са различитим флуорофорима, у случају директне имунофлуоресценције.

За истовремено обележавање у индиректној имунофлуоресценцији, потребно је осигурати да се свако примарно антитело произведе у другој животињи, као и да је свако секундарно антитело повезано са различитим флуорофором.

Попут блокаде, инкубација са антителима даје боље резултате што дуже време траје. Након сваког корака, потребно је испрати вишак антитела која се нису везала за узорке, а у секундарној имунофлуоресценцији потребно је блокирати пре додавања секундарног антитела.

Одређене технике користе друге мрље које нису повезане са имунолошким бојењем, попут обојења нуклеарне ДНК флуорофором ДАПИ.

Монтажа и посматрање

Током завршног времена инкубације са флуорофорима потребно је да узорци остану у мраку. За посматрање под микроскопом уобичајена је употреба неких супстанци за очување флуоресценције флуорофора заједно са антителима.

Врсте

Графички резиме директне и индиректне имунофлуоресценције (Извор: Вестхаил618 виа Викимедиа Цоммонс)

Директна или примарна имунофлуоресценција

То има везе са детекцијом антигена коришћењем флуоресцентних антитела. Главна предност употребе ове технике је њена брзина, међутим, у процесу се могу јавити многи случајеви неспецифичног везивања, посебно током проучавања хуманих серума, пошто су богата високо хетерогеним антителима.

Индиректна или секундарна имунофлуоресценција

Такође је позната и као техника „сендвича“, а то укључује развој технике у два корака. Прво се односи на употребу не-флуоресцентног антитела и његово везивање за интересни антиген.

Насупрот константном региону овог првог антитела (које ће сада служити као антиген) користи се друго антитело способно да га препозна, које је повезано са флуоресцентним молекулом.

Појава флуоресцентног сигнала биће резултат специфичног препознавања између првог не-флуоресцентног антитела и антигена који вас занима; присуство овог првог антитела условљава оно друго, које је обележено и захваљујући коме се може утврдити присуство или одсуство антигена.

Иако је много дужа техника него директна имунофлуоресценција (пошто укључује још један корак инкубације), ова техника не укључује дизајн флуоресцентног антитела за сваки проучени антиген, што резултира у економском смислу, одрживији.

Даље, то је осетљивија техника у погледу појачања сигнала, јер се више од једног секундарног антитела може везати за константно подручје примарног антитела, појачавајући тако интензитет флуоресцентног сигнала.

Апликације

Као што смо већ напоменули, имунофлуоресценција је изузетно свестрана техника која се на више начина користи у научној и клиничкој области. Може се користити за одговор на еколошка, генетска и физиолошка питања која се тичу многих организама.

Међу клиничким апликацијама користи се за директну дијагнозу неких дерматолошких болести, било коришћењем директне или индиректне имунофлуоресценције на епителном ткиву испитиваних пацијената.

Технике имунофлуоресценције биле су доступне у једноћелијским организмима, као што су квас за визуелизацију унутарједроенергетских и цитоплазматских микротубула, актина и придружених протеина, филамената од 10 нм и других састојака цитоплазме, мембране и ћелијских зидова.

Референце

1. Абцам, имуноцитохемија и имунофлуоресцентни протокол. Преузето са абцам.цом
2. Грепх, Ц. (2012). Флуоресцентне боје. Преузето са леица-мицросистемс.цом
3. Миллер, ДМ, и Схакест, ДЦ (1995). Имунофлуоресцентна микроскопија. Ин Метходс ин Целл Биологи (Вол. 48, стр. 365–394). Ацадемиц Пресс, Инц.
4. Оделл, ИД и Цоок, Д. (2013). Имунофлуоресцентне технике. Часопис за истраживачку дерматологију, 133, 1–4.
5. Принцле, БЈР, Адамс, АЕМ, Друаин, ДГ, и Бриан, К. (1991). Имунофлуоресцентне методе за квас. Ин Метходс оф Ензимологи (Вол. 194, стр. 565–602). Ацадемиц Пресс, Инц.
6. Сцхаеффер, М., Орси, Е. В и Виделоцк, Д. (1964). Примене имунофлуоресценције у јавноздравственој вирологији. Бактериолошки прегледи, 28 (4), 402–408.
7. Вриелинг, ЕГ и Андерсон, ДМ (1996). Имунофлуоресценција у истраживању фитопланктона: апликације и потенцијал. Ј: Пхицол. , 32, 1–16.