ВРИГХТ-ОВА МРЉА: ОБРАЗЛОЖЕЊЕ, МАТЕРИЈАЛИ, ТЕХНИКА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЈА - 2025

Рајт мрља је техника бојења створио амерички патолог Јамес Хомер Вригхт 1902, на основу Романовски мрље. Пошто је Романовска мрља била нестабилна, Вригхт је метанол укључио као растварач и фиксатив.

Ово је бојање поликромно, што значи да ствара неколико боја, зависно од структуре која апсорбује боју. Ова техника бојења се широко користи за обављање диференцијалног броја белих крвних зрнаца и за проучавање морфологије црвених крвних зрнаца, тромбоцита и леукоцита у периферној крви и коштаној сржи.

Различити мрље периферне крви обојене Вригхтовом флеком. А. Акутна леукемија Б. Пласмодиум вивак унутар еритроцита. Ц. Пласмодиум фалципарум, макрогетоцит. Д. Лимфоцити

Његова примена је веома важна, јер се неправилности могу видети у различитим ћелијским линијама крви, што олакшава дијагнозу болести попут леукемије или бактеријских или паразитских инфекција.

Можда су то најчешће примене у којима се ова техника користи, али оне нису једине. Такође је корисна у узорцима осим крви и коштане сржи, као што су цурење из носа, фекална слуз, испљувак, узорци коже, између осталих.

Образложење Вригхтове мрље

Вригхтова мрља настала је од Романовске мрље, која се састоји од метилног алкохола раствора киселог бојила (еозин И) и основног бојила (метилен плава) и њихових производа оксидације.

Мешавина боја која се користи у Вригхт мрљи изазива ефекат познат као Романовски, односно даје лепу љубичасту боју језграма леукоцита и неутрофилних гранула, док црвене крвне ћелије обојају ружичасто.

Компоненте одговорне за давање типичне боје боја Вригхт-ове мрље су плава Б и еозин И. Примећени ефекат ће зависити од везивања боја за хемијске структуре и интеракције плавог Б и еозина И.

Киселе структуре попут нуклеинских киселина, нуклеарних протеина и реактивне незреле цитоплазме неких типова ћелија фиксирају плави Б (основна мрља).

Док основне структуре попут хемоглобина, грануле сегментираних еозинофила, између осталих ћелијских структура, фиксирају еозин И (кисело бојило).

На резултат бојења могу утицати различити фактори, као што је пХ Вригхт боје, пуфера и раствора за прање; као и време бојења и фиксирања.

Стога је сваки корак у припреми реагенса од пресудног значаја и мора се извести с пажњом на сваки детаљ.

материјали

Вригхт је мрља. За 100 мл потребно је:

Измерити 0,3 г Вригхт-ове флеке, измерити 97 мл метанола и 3 мл глицерола.

Припрема

У малтер ставите велику количину Вригхтове боје и постепено додајте глицерол све док се прах потпуно не растопи.

Након тога се додаје метанол, меша и сипа у амбре-боцу.

Пре употребе, раствор треба лагано протрести и филтрирати.

Пуферисани раствор пуфера

У једном литру дестиловане воде, 3.76 г динатријум хидропхоспхате (На ₂ ХПО ₄ 2Х ₂ 0) плус 2.1 г дихидроген калијум фосфата (КХ ₂ ПО ₄ се додају).

Врло добро мешајте док се сви уграђени реагенси не растопе. Подесите пХ на 7,2. Сипајте у стаклену теглу и чувајте на собној температури.

Додатни материјали потребни за обављање бојања

Поред тога, потребни су и други материјали да би могли да примењују технику бојања, а то су: предметни тобоган или поклопци, мост за бојање, мајице са водом или тампон за прање, штоперица за чување времена бојања и нешто сушеног материјала (упијајући папир, газа или памук).

Компоненте Вригхтове мрље

Метанол

Алкохол (метанол) служи као фиксатив бриса крви на клизачу.

У основи је реагенс за смањење коагуланта, дехидратацију и фиксирање. Стога је његова функција да згрушава протеине и учини их нерастворљивим, али без да их заправо денатурише.

Метанол је најчешће коришћени реагенс за фиксирање размаза у свим лабораторијама, јер даје боље резултате од етанола. Идеална концентрација је 99%.

Дампер

Пуфер (пуферирани раствор) има функцију подешавања или одржавања пХ боје, јер је пХ подешен на 7,2 од суштинског значаја за ћелијске структуре да могу правилно апсорбовати боје.

С друге стране, корак фиксације метанола дехидрира ћелије, а пуфер помаже да их рехидрира.

Еосин (И)

Еосин има афинитет према грађевинским блоковима јер је кисело бојило. Познате су две врсте еозина врло сличне једна другој, толико да се било која од њих може користити, а да се добије исти резултат.

Један се зове еозин И, жути еозин или тетрабромофлуоресцеин, а други се назива еозин Б, плавкаст еритросин Б или дибромодинитрофлуоресцеин. Међутим, еозин И се најчешће користи.

Најважније својство ове боје је њен негативни поларитет, због чега је привлачен позитивно наелектрисаним ћелијским структурама.

Метилен плаво

То је основно бојање. Његово главно својство је метахромасија, то јест, неће све структуре бити обојене истом бојом, то зависи од хемијског састава обојених структура.

Неки ће постати свијетло или тамно плави, а неки ће постати тамно љубичасти или блиједо љубичасти.

Техника

1 -Изразите узорак тако да остане танак филм на клизачу или на прекривачу.

2-Оставите да се суши на ваздуху отприлике 2 сата.

3 -Поставите суву мрљу на мост за цртање и подлогу за бојење тако да узорак буде ширен према горе.

4 Покријте лист капљицом Вригхт кап по кап, док се цела површина не прекрива. Оставите 5 - 8 минута.

5-мрља треба у потпуности да покрије клизач, без преливања по ивицама. Ако током времена бојања почне да испарава, додајте неколико додатних капи.

6-Затим додајте једнаку количину амортизера, мало пробушите док се не појави карактеристични метални сјај. Време 10 до 15 минута.

7-Оперите водом из славине, стављајући њежни ток док лист не постане ружичаст.

8 - Помоћу газе натопљене у алкохолу уклоните боју залепљену на стражњој страни клизача.

9 - Оставите да се брис добро осуши пре стављања урањајућег уља да бисте га погледали под микроскопом.

Корисност

Хематологија

Идеалан је за бојење периферних мрља крви, за испитивање густих мрља крви и за проучавање ћелија из узорака коштане сржи.

Због хемијских својстава ове комбинације боја, ћелијске структуре се лако препознају и могу се разликовати различите врсте ћелија.

Цурење из носа

Ова техника је веома корисна за препознавање ћелија носног пражњења (епителне ћелије, сегментирани еозинофили, полиморфонуклеарне ћелије) у дијагнози алергијског ринитиса.

паразитологија

У том смислу, било је корисно за проучавање Леисхманиа сп унутар хистиоцита поткожног ћелијског ткива у кожним чирима. Исто тако, користи се за идентификацију леукоцита у узорцима столице (фекални леукограм).

У овом случају, за лекара је интересантно да зна да ли је леукоцитоза присутна у столици полиморфануклеарна или мононуклеарна. Ово откриће фекалног леукограма ће водити да ли је то бактеријска или вирусна инфекција.

С друге стране, паразити који циркулирају у крви могу се наћи унутар еритроцита или слободни у плазми. Тражени паразити су Пласмодиум спп, Трипаносома црузии и филариас, а у ветеринарској медицини је користан у потрази за Тхеилериа екуи и Бабесиа цабалли, узрочницима бебесиозе, нарочито код коња.

Вригхт мрља, као и мрља Гиемса омогућавају разликовање хемопаразита од нормалних ћелијских компоненти. За то се могу користити две врсте намаза:

Размажите танко

Крв се шири као танки филм на тобогану. Бојена је Вригхт-овом мрљом, откривајући карактеристике језгра и цитоплазме.

Дебела кап

Ова методологија користи се за испитивање присуства паразита у већој количини крви.

Да бисте то учинили, велика капљица крви стави се на слајд. Кад је тамо, мора се дефибрилирати, правећи све веће и веће кругове од средишта ка споља, користећи ивицу другог клизача.

Коначно, да бисте могли да посматрате паразите у густом размазу, еритроцити се морају лизирати водом.

Респираторне инфекције

На респираторном нивоу, ова техника је такође корисна, јер су ћелије присутне у узорцима спутума, испирања бронха или бронхоалвеолара важне за постављање дијагнозе.

Слично, овде се могу разликовати полиморфонуклеарне ћелије и мононуклеарне ћелије.

Бактериологија

Употреба ове технике у бактериологији је ограничена, јер није добра за бојење бактерија, због чега се за њихово бојење користе друге специјализоване технике бојења.

Међутим, коришћена је за тражење епителних ћелија са Цхламидиа трацхоматис телима за укључивање у уретралне или ендоцервикалне брисе слузнице, мада мора бити признато да то није најбоља метода за то.

Такође је могуће опазити спирално сличне бактерије као што је Боррелиа бургдорфери међу црвеним крвним ћелијама код заражених пацијената, као и морула или инклузијска тела Ехрлицхиа сп у цитоплазми лимфоцита, моноцита или неутрофила у крвном брису.

Мицологи

Хистоплазма цапсулатум је патогена гљивица која се често дијагностикује микроскопским надгледањем различитих узорака ткива обојених Вригхт-овом флеком.

Како се опажају структуре узорка крви са Вригхтовом флеком?

Извор: Ретамалес Е, Институт за јавно здравље Мазо В., Влада Чилеа. Препоруке за мрље на крвним мрљама за читање хемограма.

Препоруке за добро бојење

Крста за узорке крви треба да се спонтано осуше. Размази требају бити што је могуће тањи како би се постигла боља фиксација боје и избјегла прекомјерна мрља.

За висококвалитетно бојење, препоручљиво је да се обоји у року од два сата након припреме бриса. Са друге стране, идеалан узорак је капиларна крв, без антикоагуланса.

Међутим, ако се користи венска крв, треба је користити као антикоагуланс ЕДТА, а не хепарин, јер последњи може деформисати ћелијске структуре.

Да би се избегло пропадање припремљеног бојила, треба га чувати на сувим местима.

Током процеса прања препоручује се употреба воде прилагођене неутралном пХ.

На крају, препоручљиво је повремено тестирати методе бојења које се користе у лабораторији.

То се постиже бојењем узорака или проширеним узорцима, као контрола квалитета. Овај корак је важан, јер осигурава да се бојење правилно припреми и времена бојења су добро стандардизована.

Ако је лист обрасца лоше обојен, постоје проблеми који се морају решити.

Честе грешке у Вригхт боји

Веома бледо бојење

Веома бледо мрље настају обично због врло кратког времена бојења или превеликог прања. Исправља се продужењем времена контакта са бојом или смањењем времена прања.

Талог боје

Присуство талога боје у размазу може имати неколико узрока, међутим, најчешћи узроци су: употреба нефилтрираног бојила, бојење на неравним мостовима за бојење, коришћење листова прљавих прашином или мастима, а не добро испирање потпуно обојење.

Изузетно црвени или плави размаз

Пуфер је одговоран за пХ боје. Боје са пХ испод назначеног (киселе) ће резултирати врло црвенкастим мрљама.

Ако је пХ боје изнад (алкалног), добиће се изузетно плавкаст размаз.

Режим складиштења

Реагенс треба чувати на собној температури.

Референце

1. Гутиеррез В. Упоредна студија између Вригхт-ове методе бојења и Елиса теста за дијагнозу пасје ехрлицхиозе у граду Сан Педро Сула, Хондурас. 2008. Дипломски рад да би се квалификовао за Ветеринарски медицински степен. Универзитет Сан Карлос из Гватемале.
2. Лопез-Јацоме Л, Хернандез-Дуран М, Цолин-Цастро Ц, Ортега-Пена С, Церон-Гонзалез Г, Францо-Цендејас Ф. Основне мрље у микробиолошкој лабораторији. Истраживање инвалидности. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Вригхт је мрља." Википедија, Слободна енциклопедија. 18 мај 2018, 12:05 УТЦ 8 децембар 2018, 20:37
4. Цалдерон А, Цардона Ј, Вергара О. Учесталост бактерије Бабесиа спп. у лову на коње, Кордоба (Колумбија). Рев. удцаацтуал дивулг циент. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Форбес Б, Сахм Д, Веиссфелд А (2009). Баилеи & Сцотт Микробиолошка дијагноза. 12 ед. Аргентина. Редакција Панамерицана СА
6. Ретамалес Е, Мазо В. Институт за јавно здравство Чилеа. Препоруке за мрље на крвним мрљама за читање хемограма.