СТАНДАРДНА АГАР КУГЛИЦА: ОБРАДА, ПРИПРЕМА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЈА - 2025

Стандардни цоунт агар је чврста, неселективни култивирани медиј, намењен за квантификацију аеробне микробне оптерећења присутна у узорцима питке воде, отпадне воде, млечне пића, између осталих намирница. Овај медијум је такође познат и као ПЦА агар, по својој кратици на енглеском Плате Цоунт Агар. Створили су га 1953. године Буцхбиндер, Барис и Голдстеин.

Стандардни агар мед за бројање се састоји од екстракта квасца, триптеина, глукозе, агара и дестиловане воде. Ова формулација садржи основне прехрамбене елементе који омогућавају развој постојећег аеробног оптерећења микроба, а не захтевно.

Децимална разблажења за бројање ЦФУ-а у стандардном бројачу агара. Извор: Куентин Геиссманн

Како медијум не садржи инхибиторе, бактерије могу расти без икаквих ограничења, што га чини идеалним за опште бројање колонија. Међутим, техника квантификације плака неће открити све присутне бактерије, већ само оне које су способне да расту у условима животне средине којима је подвргнут сетвени стандардни агар.

У том смислу, техником квантификације плоча углавном се жели утврдити количина бактерија аеробног мезофилног типа, односно оних које расту на температури између 25 и 40 ° Ц, са оптималном температуром раста од 37 ° Ц. .

Ова бактеријска група је веома важна, јер се већина патогених бактерија за човек налази тамо.

Треба напоменути да понекад може бити занимљиво квантифицирати количину психрофичних бактерија присутних у храни. Ове бактерије су оне које расту на ниским температурама (<20 ° Ц) и одговорне су за брже разградњу хране, чак и када су у хладњаку.

Исто тако, термофилне бактерије, које се развијају у распону између 50 ° Ц и 80 ° Ц или више, могу бити важне у одређеним врстама хране, попут конзервиране хране.

Квантификација микробима изражена је у јединицама које формирају колонију (ЦФУ) по граму или милилитру узорка.

Основе

Стандардни медијум за бројање осмишљен је да омогући успешан раст нехрабривих аеробних бактерија, као што су екстракт квасца, тритеин и глукоза који обезбеђују потребне храњиве састојке за добар раст микроба.

С друге стране, подлога има светлу боју и транспарентан изглед, због чега је идеалан за визуелизацију колонија развијених методом дубоког сетве (изливање плоча).

Такође је могуће и бројање колонија методом површинске сетве Дригалски лопатице.

Када је оптерећење микробиома велико, потребно је извршити децимална разблажења узорка, да би се могли израчунати ЦФУ.

Треба напоменути да овај број препоручује Америчко удружење за јавно здравље (АПХА) за бројање аеробних мезофила.

Припрема

Измери се 23,5 г дехидрираног медијума и раствара се у литру дестиловане воде. Да би се потпуно растопила, смесу треба загревати уз често мешање док не прокључа. Накнадни кораци зависе од технике сетве која ће се користити.

За технику лијевања плоча

Расподелите тако да распршите 12 до 15 мл у епрувете. Након тога, стерилизирајте у аутоклаву на 121 ° Ц током 15 минута. Оставите да се очврсне очврсне у облику блока. Чувати у фрижидеру до употребе.

Отопите чеп када га желите користити. Након што се отопи, држите га у воденој купељи на 44-47 ° Ц, док су узорци припремљени.

За површинску сјетву

Стерилизовати медијум у аутоклаву на 121 ° Ц и затим дистрибуирати 20 мл у стерилним Петријевим посудама. Оставите да се стврдне, преокрените и чувајте у фрижидеру до употребе.

Плоче за темперирање пре употребе. ПХ медијума треба да буде 7,0 ± 0,2.

Употреба

Стандардни агар са бројевима користи се у техници аеробног бројања мезофила током микробиолошке анализе воде и хране. Број аеробних мезофила је неопходан јер одређује санитарни квалитет узорка који се проучава.

Примена ове технике (коришћењем овог медијума) омогућава макроскопску визуелизацију изолованих колонија ради њиховог квантификације.

Техника наливања плоча (дубинско сејање)

-Процес

Техника се састоји од следећег:

1) Хомогенизирати узорак да би се редистрибуирале присутне бактерије.

2) Почетна суспензија је направљена у стерилној боци или кесици, поштујући однос 10 гр или 10 мл узорка у 90 мл разблаживача (10 ^-1 ).

3) Од почетне суспензије, одговарајућа децимална разблажења се праве у зависности од врсте узорка. Нпр: (10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ). Разблаживања се праве пепетонском водом или фосфатним пуфером.

Да бисте то учинили, узмите 1 мл почетне суспензије и ставите је у 9 мл разблаживача, наставите разблаживања ако је потребно, узимајући 1 мл разблажења 10 ^-2 и тако даље.

4) Узмите 1 мл сваког разблажења и ставите у празне стерилне Петријеве посуде.

5) Додајте на сваку плочу 12 до 15 мл стандардног агар-а, претходно растопљеног и таложеног на 44 - 47 ° Ц.

6) Лагано окрените плоче да би се узорак равномерно распоредио и оставио да се очврсне.

7) Окрените плоче и инкубирајте на 37 ° Ц у аеробиози током 24 до 48 сати.

8) На крају времена плоче су прегледане и колоније се рачунају у разблаживању које то омогућава. Они бројеви који имају између 30 и 300 ЦФУ бирају се за бројање.

Бројање се може обавити ручно или можете користити опрему бројача колоније.

Дозвољене вредности за мл узорка могу се разликовати од земље до земље, у зависности од прописа којим се уређује.

-Израчун УФЦ-а

Општи израчун се врши помоћу следеће формуле:

Формула за опште израчунавање квантификације ЦФУ-а. Извор: Национална управа за лекове, храну и медицинску технологију (АНМАТ). Микробиолошка анализа хране, званична аналитичка методологија, микроорганизми индикатори. 2014. свезак 3. Доступно на: анмат.гов.ар

Резултате изразите у 1 или 2 цифре множећи се са одговарајућом базом 10. Пример: ако је резултат 16.545, заокружен је на основу треће цифре на 17.000 и биће изражен на следећи начин: 1.7 к 10 ⁴ . Ако је резултат 16,436, заокружите на 16,000 и изразите 1,6 к 10 ⁴ .

Техника површинског сејања

-Процес

-Инокуларно са 0,1 мл директног узорка ако је течан, почетна суспензија 10 ^-1 или узастопна разблажења 10 ^-2 , 10 ^-3 итд., У средини стандардне плочице са агарима за бројање.

-Поделите равномерно узорак Дригалски лопатицом или стакленом шипком у облику слова Л. Оставите да одстоји 10 минута.

-Окрените плоче и аеробно инкубирајте на 37 ° Ц током 24 до 48 сати.

- Пребројите колоније, изаберите оне плоче које се налазе у опсегу између 20 и 250 ЦФУ.

-Израчун УФЦ-а

За прорачун се користи фактор разблажења, који је обрнут. Број се заокружује на 2 значајне цифре (заокруживање према трећој цифри) и изражава се снагом базе 10. На пример, ако се 224 ЦФУ броји у узорку без разблаживања (10 ^-1 ), извештава се 22 к 10 ¹ ЦФУ. , али ако је цифра била 225, 23 х 10 ¹ ЦФУ су се пријавио.

Ако се у разблаживање 10 ^-3 броји 199 ЦФУ, пријавиће се 20 к 10 ⁴ ЦФУ, али ако се 153 ЦФУ рачуна у истом разблажењу, извештаваће се 15 к 10 ⁴ ЦФУ.

КА

Стандардни медијум за обрачун броја може се проценити коришћењем познатих сертификованих сојева, као што су: Есцхерицхиа цоли АТЦЦ 8739, Стапхилоцоццус ауреус АТЦЦ 6538, Бациллус субтилис АТЦЦ 6633, Лацтобациллус ферментум АТЦЦ 9338, Стапхилоцоццус епидермидис АТЦЦ 12228, Схигелла флекнери АТЦЦ 12022.

Ако је медијум за културу у оптималним условима, очекује се задовољавајући раст у свим случајевима, осим Л. ферментум, који може имати редован принос.

Да би се проценила стерилност медијума за културу, једна или две плоче сваке припремљене шарже (без инокулације) треба инкубирати на 37 ° Ц у аеробиози током 24 сата. Након овог времена, у медијуму не сме да се примети раст или промена боје.

Ограничења

-Не растопите агар више од једном.

-Припремљени медијум може трајати и до 3 месеца ако се чува у фрижидеру и заштићен од светлости.

-Овај медијум није погодан за захтевне или анаеробне микроорганизме.

Референце

1. Национална управа за лекове, храну и медицинску технологију (АНМАТ). Микробиолошка анализа хране, званична аналитичка методологија, микроорганизми индикатори. 2014. свезак 3. Доступно на: анмат.гов.ар
2. Лабораториос Дифцо Францисцо Сориа Мелгуизо, СА Број плоча Агар. 2009. Доступно на: хттп://ф-сориа.ес
3. Цонда Пронадиса Лабораториес. Стандардни метод Агар (ПЦА) према АПХА и ИСО 4833. Доступно на: цондалаб.цом
4. Британниа Лабораториес. Број агар плоча 2015. Доступно на: британиалаб.цом
5. Цамацхо А, Гилес М, Ортегон А, Палао М, Серрано Б и Велазкуез О. 2009. Технике микробиолошке анализе хране. 2нд ед. Хемијски факултет, УНАМ. Мексико. Доступно на: депа.фкуим.унам