МЕДИЈ ЛОВЕНСТЕИН-ЈЕНСЕН: ОСНОВА, ПРИПРЕМА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЈА - 2025

Ловенстеин-Јенсен медијум селективни чврста медиј за изолацију и развој бактерија рода Мицобацтериум, попут Мицобацтериум туберцулосис, М. авиум, између осталог, са изузетком лепрае врста, што није цултурабле.

Бактерије рода Мицобацтериум не расту у конвенционалним културама, стога је било неопходно креирати посебан медијум за њихову изолацију. Оригинални медијум је креирао Ловенстеин, а касније га је модификовао Јенсен.

Медиј Ловенстеин-Јенсен са колонијама Мицобацтериум туберцулосис. Извор: Агарвал и остали / БиоМед Централ Лтд., љубазношћу Библиотеке слика биологије

Модификација се састојала у елиминацији Конго црвене боје, замењујући је са већом концентрацијом малахит зелене боје. Такође је изменио концентрације магнезијум-цитрата и моно-калијум-фосфата.

Средство Ловенстеин-Јенсен тренутно садржи шкроб кромпира, аспарагин, магнезијум цитрат, монокалијум фосфат, магнезијум сулфат, малахит зелено, налидиксичну киселину, циклохексимид, линкомицин, претучена јаја, глицерин и воду.

Микобактерије су обично изоловане са места која нису стерилна, као што су спутум, урин, апсцеси, између осталог. То значи да ће већина узорака садржавати уобичајену микробиоту тог подручја, плус патоген.

Због тога медијум Ловенстеин-Јенсен садржи низ инхибитора у свом саставу који су представљени малахит зеленим, антибиотицима и антифунгалним средствима.

Поред тога, узорци који долазе са нестерилних локација морају се деконтаминирати и неутрализовати пре сетве у медијум Ловенстеин-Јенсен.

Основе

Присуство јаја и глицерина у медијуму Ловенстеин-Јенсен подстиче раст микобактерија јер оне обезбеђују масне киселине и протеине неопходне за развој ових микроорганизама.

Средство Ловенстеин-Јенсен садржи малахит зелено, које је инхибитор пратеће микробиоте. Али он такође садржи налидиксинску киселину (35 µг / мЛ), која инхибира Грам негативну микробиоту, циклохексимид (400 µг / мЛ), који инхибира сапрофитне гљивице и квасце, и линкомицин (2 µ / мЛ), који инхибира Грам позитивну микробиоту.

Неке комерцијалне компаније радије додају следећу комбинацију антибиотика: полимиксин Б 200.000 јединица / Л, амфотерицин Б 10 мг / Л, карбеницилин 50 мг / Л и триметоприм 10 мг / Л.

Овај медијум не садржи агар, па отврдњавање медијума долази услед коагулације албумина присутног у јајету током стерилизације.

Припрема

Одмери се 37,3 г дехидрираног медијума у ​​600 мл дестиловане воде којој је претходно додато 12 мл глицерола. Смеша се загрева, често мешајући док се потпуно не растопи. Аутоклавите медијум на 121 ° Ц током 15 минута.

С друге стране, у асептичним условима треба припремити хомогену суспензију од 1000 мл свежих јаја. Додајте суспензију јаја у 600 мл медијума припремљеног на температури 50 - 60 ° Ц, избегавајући мехуриће ваздуха.

Антибиотски раствори се такође додају након стерилизације у аутоклаву.

Сипајте медијум у стерилне епрувете са затвореним вијком. Загревајте епрувете на 85 ° Ц током 45 минута у нагнутом положају.

Боја припремљеног медијума је аквамарин зелена и може да представља беличасте мрље због присуства јајних липида.

ПХ медијума мора бити 7,2 ± 0,2

Чувајте епрувете у фрижидеру и заштићене од директног светла до употребе. Температура пре сетве.

Постоји модификација медија под називом „Груфт модификација Ловенстеин Јенсен“. Ово садржи иста једињења као и класични медијум, али додаје се РНА-5мг / 100 мЛ, а као инхибитори садржи малахит зелено 0,025 г / 100 мЛ, пеницилин 50 У / мЛ и налидиксичну киселину 35 уг / мЛ.

Апликације

Средство Ловенстеин-Јенсен користи се за изоловање микобактерија из различитих врста узорака. Боја од Зиехл-Неелсен-а препоручује се за сваки узорак у којем се сумња на присуство микобактерија.

Неки узорци долазе са стерилних локација, а други не. Нестерилни узорци морају се по потреби деконтаминирати:

Спутум

Узорке спутума треба деконтаминирати на следећи начин: одредите количину узорка испљувака у мл и додајте исту количину 4% НаОХ у узорак и инкубирајте на 37 ° Ц.

Мешајте мешавину често у року од 30 минута. Затим центрифугирајте на 3000 РПМ током 30 минута.

Одбаците супернатант преко фенолног раствора за дезинфекцију. За сјетву користите седимент, али најприје пХ мора бити неутрализован.

Да се неутрализује седимент, 5% Х ₂ СО ₄ користи у присуству фенол црвеног индикатора док не достигне неутрални пХ који изазива боју лососа.

Испирање желуца, испирање бронха и бронхијални аспират

У том случају, узорак се мора центрифугирати на 3000 РПМ током 30 минута. Супернатант се одбацује и пелет се користи. Да бисте деконтаминирали седимент, додајте 3 мл 4% НаОХ и често мешајте на 37 ° Ц током пола сата.

Центрифуга поново, супернатант се одбацује и пелет се користи. Потоњи се морају неутрализовати као што је објашњено у узорку спутума.

Урин

Оставите узорак да се слегне у фрижидеру 24 сата. Одвојите супернатант. Преостали пелет треба центрифугирати 30 минута на 3000 РМП. Поново одбаците супернатант и отопите пелет са 3 мл стерилног физиолошког раствора.

Додајте 3 мл 4% НаОХ и наставите са деконтаминацијом и неутрализацијом као што је претходно описано.

Асцитес течност, плеурална течност, цереброспинална течност

У овој врсти узорка се центрифугира и супернатант се одбацује. Изведите Грам на седименту или посматрајте директно под микроскопом; Ако се не примете бактерије, корак деконтаминације није неопходан, нити је корак неутрализације.

У овом случају узорак се може сејати директно користећи седимент. Ако има бактерија, наставите са деконтаминирањем и неутрализовањем као што је горе описано.

Биопсије

Овом типу узорка треба додати 5 мл дестиловане воде да би се касније центрифугирало на 1500 обртаја у минути током 10 минута. Одбаците супернатант и поново центрифугирајте пелет при 3500 о / мин током 30 минута. Употријебите талог за сијање културе културе.

Ларинални брис

Брис треба поставити у стерилну епрувету која садржи једнаке делове дестиловане воде и 4% НаОХ. Брис се мора притиснути на зидове епрувете, тако да се узорак разблажи у течности. Центрифугирајте и користите талог. Неутрализирајте талог како је већ описано.

Засејано

Медијум Ловенстеин-Јенсен инокулира се додавањем 0,5 мл узорка на површину медијума. Закрените епрувету да бисте расподељели узорак кроз медијум. Не користите платинасту дршку.

Друга епрувета која садржи Стонебринк медијум може се сејати да би се изоловала врста Мицобацтериум бовис и других врста које не расту на медијуму Ловенстеин-Јенсен.

Инкубација

Инокулиране епрувете се инкубирају аеробно на 37 ° Ц, а поклопац је мало лабав и нагнут на приближно 5 ° и заштићен од светлости. Околина се може обогатити са 5–10% угљен-диоксида. Два пута недељно прегледајте културе док се не појаве колоније.

Када је узорак апсорбован, капице се стежу. Максимално време инкубације је 8 недеља, уколико после тог времена не дође до раста, то се наводи као негативно.

КА

Следећи сојеви се могу користити као контрола квалитета:

Мицобацтериум туберцулосис АТЦЦ 27294, Мицобацтериум кансасии АТЦЦ 12478, Мицобацтериум авиум АТЦЦ 19291, Мицобацтериум бовис АТЦЦ 19219, Мицобацтериум фортуитум АТЦЦ 6841, Есцхерицхиа цоли АТЦЦ 25922, Стрептоцоццус пиогенес АТЦЦ 19615, Цриптоцоццус 320оф АТЦЦ од 19615, Цриптоцоццус 320оф АТЦЦ оф нематоцоццус 320оф

За прве три поменуте врсте очекује се одличан развој, за раст М. фортуитум треба да буде добар, док је за М. бовис мали или никакав раст не очекује. У међувремену, врсте осим рода Мицобацтериум морају се у потпуности инхибирати.

Ограничења

Припремљени медијум мора бити заштићен од светлости, дуготрајно излагање светлости узрокује да се медијум претвори из зелене у плаву, а у овом случају се више не може користити. То је зато што је малахит зелена фотосензибилна.

Медијум, јер садржи јаја, може се лако контаминирати ако се са њим не поступа асептично. Може се растворити ако постане контаминирана протеолитичким бактеријама.

Узгој и руковање бактеријама рода Мицобацтериум захтева квалификовано особље које је свесно мера биолошке безбедности које се морају следити да не би били контаминирани или контаминирали друге.

ХЦл се не сме користити у кораку неутрализације због стварања натријум-хлорида, који може бити токсичан за Коцхов бацил.

Узорци треба држати у хладњаку и заштитити их од светлости, а да се не обрађују.

Референце

1. Францисцо Сориа Мелгуизо Лабораториес. 2009. Селективни медиј Ловенстеин-Јенсен. Доступно на: ф-сориа.ес
2. Британниа Лабораториес. 2017. Ловенстеин-Јенсен медиум. Доступно на: британиалаб.цом.
3. Неоген Лабораториес. Медиј Ловенстеин-Јенсен. Доступно на: фоодсафети.неоген.цом.
4. "Медиј Ловенстеин-Јенсен." Википедија, Слободна енциклопедија. 20 новембар 2018, 15:15 УТЦ 24 април 2019, 18:34 википедиа.орг
5. Конеман Е, Аллен С, Јанда В, Сцхрецкенбергер П, Винн В. (2004). Микробиолошка дијагноза. 5. изд. Редакција Панамерицана СА Аргентина.
6. Форбес Б, Сахм Д, Веиссфелд А. (2009). Баилеи & Сцотт Микробиолошка дијагноза. 12 ед. Редакција Панамерицана СА Аргентина.
7. Мац Фаддин Ј. (2003). Биохемијска испитивања за идентификацију бактерија од клиничког значаја. 3. изд. Редакција Панамерицана. Буенос Ајрес. Аргентина.