РЕКОМБИНАНТНА ДНК: ТЕХНИКА, ПРИМЕНЕ И ОСНОВЕ - БИОЛОГИЈА - 2025

Рекомбинантне ДНК (рДНК или рДНА) је вештачка нуклеинске киселине молекул направљена у лабораторији, интегрисањем два сегмента интересних организација. Такође је позната и као химерна ДНК, захваљујући свом хибридном својству. Ова врста ДНК се не налази у природи.

Основна методологија за његово генерисање укључује: (а) избор циљане ДНК и њено убацивање у други ДНК фрагмент (углавном бактеријски плазмид); (б) увођење овог плазмида у бактерију, (ц) селекцију бактерија помоћу антибиотика и коначно (д) експресију гена.

Извор: пикабаи.цом

Ова техника користи предност ензима који омогућавају копирање и лепљење одређених фрагмената ДНК према процени истраживача.

Циљ рекомбинантне технологије је у већини случајева експресија протеина (познатог као рекомбинантни протеин) који молекулски биолог жели за будућа истраживања или за стварање протеина комерцијалне и терапеутске вредности - као што је хумани инсулин, на пример.

Основе технике рекомбинантне ДНК и њена употреба у генетском инжењерингу

Централна догма молекуларне биологије

Сва органска бића која знамо имају неколико карактеристика. Једна од њих је природа генетског материјала и начин стварања протеина - процес познат као централна „догма“ молекуларне биологије.

С изузетком неколико вируса, сви организми похрањују генетске информације у ДНК (деоксирибонуклеинска киселина), сакупљени на веома компактан и организован начин у језгру ћелије.

За експресију гена, молекул ДНК се преписује у месна РНК, а последњи се преводи у језик аминокиселина, градивних блокова протеина.

Шта је рекомбинантна ДНК?

Између 1970-их и 1980-их, молекуларни биолози су почели да користе предности процеса који се природно одвијају у ћелији и могли су да их екстраполирају у лабораторију.

На тај начин, ген животињског порекла (на пример, кичмењак) може бити убачен у сегмент ДНК из бактерије; или се бактерија ДНК може комбиновати са вирусном ДНК. На тај начин, можемо дефинисати рекомбинантну ДНК као молекул састављен од ДНК из два различита организма.

Једном када се створи овај хибридни или рекомбинантни молекул, гени који се занимају су изражени. Изразом речи желимо да се односимо на процес превођења протеина.

Рестриктивни ензими и лигазе: кључ процеса

Откривање рестрикционих ензима био је кључни елемент у развоју рекомбинантне ДНК технологије.

Ово су протеински молекули који показују способност цепања ДНК (нуклеазе) у специфичне секвенце, служећи као "молекуларне маказе". Фрагменти генерисани овим ензимима називају се фрагменти рестрикције.

Споменути ензими могу произвести симетричне резове у циљној секвенци (у оба ланца на истој висини) или асиметричне резове. Кључни аспект деловања рестрикционих ензима је тај да се након цепања ланаца добија „лабава ивица“, комплементарна другој ивици која је исељена истим ензимом.

Неки примери су ЕЦОР 1 и Сма 1. Тренутно је више од 200 врста рестрикцијских ензима познато и комерцијално доступно.

Да би биле корисне, шкаре морају бити заједно са лепком. Ово дејство заптивања ДНК (претходно третирано рестрикцијским ензимима) се врши лигазама.

Техника: како се ДНК организма вештачки модификује у лабораторији?

У наставку ћемо описати главне кораке које захтијева рекомбинантна ДНК технологија. Све то раде професионалци у лабораторији за молекуларну биологију.

Шта је "клон"?

Пре него што наставимо са експерименталним протоколом, морамо напоменути да се у молекуларној биологији и биотехнологији широко користе термини "клон" и глагол "клон". То би могло довести до конфузије.

У овом контексту, не мислимо на клонирање целог организма (као на пример у случају чувене овце Долли), већ на клонирање дела ДНК, који може бити ген. То јест, стварајући много копија - генетски идентичних - секвенце.

1. Изолација и добијање ДНК

Први корак је да одлучите који редослед желите да користите. То у потпуности зависи од истраживача и циљева његовог рада. Потом се овај ДНК мора изоловати и пречистити. Методе и поступци за постизање тога овисе о тијелу и ткиву.

Генерално, део ткива се узме и подвргне третману у пуферу за лизирање са протеиназом К (протеолитичким ензимом), а затим се екстрахује ДНК. Након тога, генетски материјал се фрагментира у мале фрагменте.

2. Вектор клонирања

Након припремних корака, истраживач покушава да уведе ДНК сегмент од интереса у вектор клонирања. Од сада ћемо овај сегмент ДНК назвати белим ДНК.

Плазмиди

Један од најчешће коришћених вектора у плазмиду бактеријског порекла. Плазмид је дволанчана кружна молекула ДНК која се природно налази у бактеријама. Они су страни бактеријском хромозому - то јест, екстрахромосомни су и налазе се у овим прокариотима природно.

Основни елементи вектора су: (а) порекло репликације, што омогућава синтезу ДНК; (б) средства за селекцију, која омогућава идентификацију организама који носе плазмид са циљаном ДНК, као што је резистенција на неки антибиотик; и (ц) место мултиклонирања, где се налазе секвенце које ће препознати рестрикциони ензими.

Прва успешна рекомбинантна ДНК у лабораторији клонирана је у плазмид пСЦ101 из бактерије Е. цоли. Оно садржи место рестрикције за рестрикцијски ензим ЕцоРИ и ген за резистенцију на антибиотик, поред порекла репликације.

Уметање циљне ДНК у плазмид врши се коришћењем молекуларних алата рестрикционих ензима и лигаза описаних у претходном одељку.

Преостали типови вектора

Поред плазмида, ДНК се може убацити у друге векторе, као што су ламбда бактериофага, космиди, ИАЦ (вештачки хромосоми квасца), БАЦ (вештачки бактеријски хромозоми) и фагемиди.

3. Увођење рекомбинантне ДНК

Једном када се добије рекомбинантни молекул ДНК (ген који занима за плазмид или други вектор), он се уноси у организам домаћина или домаћина, што може бити бактерија.

За увођење страних ДНК у бактерију користи се техника звана бактеријска трансформација, где се организам подвргава третману двовалентним катионима који га чине подложним уносу ДНК.

Методолошки, не можемо гарантовати да су 100% бактерија у нашој култури ефикасно преузеле наш рекомбинантни молекул ДНК. Ту долази у игру део плазмида који садржи резистенцију на антибиотике.

Тако ће бактерије које су преузеле плазмид бити отпорне на одређени антибиотик. Да бисте их одабрали, довољно ће бити применити наведени антибиотик и одвести преживеле.

4. "Жетва" протеина

Након одабира бактерија с нашим рекомбинантним ДНК, настављамо са кориштењем домаћих ензиматских машина за генерисање протеина који су од интереса. Како се бактерије размножавају, плазмид се преноси на њихово потомство, тако да се током дељења не губи.

Овим поступком бактерије се користе као врста фабрике протеина. Касније ћемо видети да је то био врло релевантан поступак у развоју ефикасних медицинских третмана.

Једном када је култура спремна и бактерије су произвеле велике количине протеина, ћелија се лизира или уништава. Постоји широк спектар биохемијских техника које омогућавају прочишћавање протеина у складу са њиховим физичко-хемијским карактеристикама.

У другом експерименталном контексту нас можда неће занимати стварање протеина, већ смо заинтересовани за добијање ДНК секвенце по себи. Да је то случај, плазмид би се користио за стварање вишеструких копија фрагмента који нас занима како бисмо имали довољно циљне ДНК за провођење релевантних експеримената.

Апликације

Рекомбинантна ДНК технологија отворила је безброј могућности у молекуларној биологији, биотехнологији, медицини и другим сродним областима. Његове најистакнутије апликације су следеће.

Генетска анализа

Прва примена је директно повезана са лабораторијама молекуларне биологије. Рекомбинантна ДНК технологија омогућава истраживачима да разумију нормалну функцију гена, а генерисани протеини се могу користити у даљем истраживању.

Фармацеутска индустрија

Протеини произведени коришћењем поступка рекомбинантне ДНК имају примену у медицини. Два веома релевантна примера на овом пољу су хумани инсулин и хормон раста, који се примењује код пацијената којима недостаје овај протеин.

Захваљујући рекомбинантној ДНК, ови протеини могу да се генеришу без потребе да их се екстрахира од другог човека, што представља додатне методолошке компликације и ризике по здравље. Ово је помогло у побољшању квалитета живота за безброј пацијената.

Референце

1. Баца, ЛЕЛ, & Алварез, ЦЛЦ (2015). Биологија 2 Групо едитор Патриа.
2. Цоопер, ГМ, Хаусман, РЕ и Хаусман, РЕ (2000). Ћелија: молекуларни приступ (Вол. 10). Васхингтон, ДЦ: АСМ пресс.
3. Девлин, ТМ (2004). Биохемија: уџбеник са клиничком применом. Преокренуо сам се.
4. Кхан, С., Уллах, МВ, Сиддикуе, Р., Наби, Г., Манан, С., Иоусаф, М., & Хоу, Х. (2016). Улога рекомбинантне ДНК технологије за побољшање живота. Међународни часопис за геномику, 2016, 2405954.
5. Миндан, ФП, и Миндан, П. (1996). Патолошка анатомија. Елсевиер Шпанија.
6. Тортора, ГЈ, Функе, БР, & Цасе, ЦЛ (2007). Увод у микробиологију. Панамерицан Медицал Ед.
7. Тхе МЈ (1989). Људски инсулин: први лек ДНК технологије. Америцан Јоурнал оф Хеалтх-Систем Пхармаци, 46 (11_суппл), С9-С11.