ФОСФАТНИ ПУФЕР (ПБС): ОБРАЗЛОЖЕЊЕ, ПРИПРЕМА И УПОТРЕБА - БИОЛОГИЈА - 2025

Фосфатни пуфер, слани фосфатни пуфер или БПС представља тампон изотонични, чија је функција да одржи пХ и осмотски притисак што ближе природног биолошког окружења (физиолошке). ПБС акроним означава физиолошку отопину пуферу фосфата.

ПХ и осмоларност су два веома важна аспекта која се морају контролисати у одређеним лабораторијским протоколима. У случају пХ, неопходно је да се он контролише, посебно у биохемијским реакцијама, јер оне могу варирати или се не могу спровести ако су реактанти на неприкладном пХ.

ПБС-пуфер са фосфатом са два различита пХ. Извор: Пикинио.цом

У међувремену, контрола осмоларности је неопходна посебно у раду са живим ћелијама, јер плазма мембране ћелија реагују у складу са концентрацијом растворених супстанци у којима се налазе.

Ако се ћелије пренесу у хипертонични медијум, постаће дехидриране, будући да ће се градијент воде превести на страну где је већа концентрација раствора. Ако се, с друге стране, ћелије ставе у хипотонични медијум, ћелије ће апсорбовати течност док не буду лизиране.

Због тога се ПБС пуфер користи за лабораторијске протоколе који захтевају одржавање ћелија ин витро, на тај начин ћелије неће бити оштећене.

ПБС је састављен од комбинације соли, као што су натријум хлорид, натријум-фосфат, калијум хлорид и калијум фосфат. Састав ПБС-а може да варира у зависности од протокола.

Основе

Функција фосфатног пуфера је у основи одржавање константног физиолошког пХ заједно са концентрацијом електролита сличном оној која се налази у телу.

У овом окружењу ћелије су у стању да остану стабилне, јер су физиолошка стања симулирана што је више могуће.

Остала једињења се могу додати оригиналној ПБС формулацији ако је потребно, на пример, додавање ЕДТА пуферу је корисно за испирање црвених крвних зрнаца у тесту унакрсне неспојивости.

ЕДТА спречава да се фракција комплемента Ц1 присутна у серуму цепи и лизира до црвених крвних зрнаца, односно избегава лажне резултате неспојивости. Поред тога, ЕДТА помаже да се ћелије одвоје.

Припрема

Количина соли која мора да се одмери за добијање физиолошког раствора пуферираног фосфатом фосфата зависиће од количине која се мора припремити:

-Солни раствор са пуфером фосфата (10Кс ПБС)

За литру раствора:

Да одмери:

80,6 г НаЦл,

2,2 г КЦл,

11,5 г На ₂ ОВП ₄ ,

2,0 КХ ₂ ХПО ₄

Техника припреме

Ставите тешке соли у чашу, додајте довољно воде (80%) и мешајте на плочи за мешање магнетном траком док се соли не растопе.

Припрема ПБС-а коришћењем мешајуће плоче са магнетном шипком. Извор: Корисник: Рухрфисцх, Википедиа. цом

Филтрирајте да бисте уклонили неразтопљене честице. Користите филтере са 0,45 µм поре. Аутоклавите и асептично распоредите у поклопцу за ламинарни проток у стакленим посудама са поклопцима.

10Кс раствор (концентрован) не подешава пХ. Подешавање се врши када је разблажен до концентрације 1Кс ПБС пуфера (разблажење 1:10).

-Буфер фосфатни слани раствор (1Кс ПБС)

1Кс ПБС се може припремити директно одмеравањем одговарајућих количина сваке соли или се може припремити разблаживањем основног раствора (1:10) стерилном дестилованом водом.

-Да бисте директно припремили литру физиолошког пуфера са 1Кс ПБС фосфатом, измерите:

8,06 г НаЦл,

0,22 г КЦл,

1.15 г На ₂ ОВП ₄ ,

0.20 г КХ ₂ ХПО ₄

Техника припреме

Поступак као што је објашњено у концентрованом раствору. Након тога, пХ се мора подесити. Да бисте то учинили измерите пХ и у зависности од резултата користите киселину (ХЦл) или базу (НаОХ) да бисте по потреби снизили или повисили пХ, све док не буде 7.4.

Киселина или база се додају кап по кап током праћења пХ вредности раствора коришћењем пХ метра. Филтрирајте, аутоклавите и асептично распоредите у конусне цеви или тегле по потреби.

-Припремити 1Кс ПБС из 10Кс основног раствора:

Направите 1:10 разређивање. На пример, да бисте припремили 1 литар 1Кс ПБС-а, одмерите 100 мл основног раствора и додајте 700 мл стерилне дестиловане воде. Подесите пХ и напуните количину воде до 1000 мл.

Припремљени ПБС пуфер је безбојан и чист.

Дневни ПБС се може чувати на собној температури, а остатак у фрижидеру.

Раствори за подешавање пХ

ХЦл

За 100 мл 1 моларне ХЦЛ (хлороводоничне киселине).

Измерите 91 мЛ дестиловане воде и ставите је у чашу од 250 мл.

Измерите 8,62 мл концентроване ХЦл и полако је додајте у чашу која садржи воду (никада је не радите обрнуто). Предузмите одговарајуће мере биолошке безбедности када рукујете јаким киселинама (јако корозивна супстанца).

Мешајте 5 минута, пожељно користећи плочу за мешање са магнетном шипком унутар чаше. Трансфер мл балон 100 и чине до 100 мл са дестилованом Х ₂ О.

НаОХ

За 100 мл НаОХ (натријум хидроксид) 10 мола.

Измерите 40 мл дестиловане воде и ставите је у чашу од 250 мл. Измерите 40 г НаОХ и додајте у воду. Помешајте помоћу плоче за мешање са магнетном шипком унутар чаше.

Пребацити у волуметријску тиквицу од 100 мл и надопунити до ознаке дестилованом водом. Придржавајте се прописа о биолошкој сигурности, јер је ова реакција егзотермна (ослобађа енергију у облику топлоте).

Ако желите да припремите остале количине физиолошког физиолошког раствора, можете да потражите следећу табелу:

Извор: «Лабораторија за вирусну и хуману геномику, Медицинска школа УАСЛП»

Апликације

Првенствено се користи у ћелијској биологији, имунологији, имунохистохемији, бактериологији, вирологији и истраживачким лабораторијама.

Идеалан је за испирање ћелија центрифугирањем (црвених крвних зрнаца), испирање ћелија на вишеслојни начин, у техникама спектроскопске елипсометрије, у квантификацији бактеријских биофилма, у одржавању ћелијских култура за вирусе, као средство за прање у техници индиректне имунофлуоресценције. и у техникама за карактеризацију моноклонских антитела.

Такође се користи за транспорт ћелија или ткива, као разређивач за бројање ћелија, за припрему ћелијских ензима (трипсин), као разблаживач за методу сушења биомолекула и за припрему других реагенса.

С друге стране, Мартин и др. 2006. године показали су да је ПБС користан у форензичким лабораторијама, посебно у враћању сперме из вагиналних мрља или у враћању вагиналних ћелија из бриса пениса. На овај начин се може утврдити да ли је било сексуалних односа.

Ограничења

-Неки ПБС пуфери садрже супстанцу названу натријум азид као конзерванс. Ово једињење може да ствара експлозивне материје ако дође у контакт са оловом или бакром. Из тог разлога, посебно пазити приликом одлагања овог реагенса кроз одвод. Ако се одбаци на овај начин, мора се додати пуно воде да би се то разблажило што је више могуће.

-Цинк се не сме додати фосфатном пуферу, јер он изазива талог неких соли.

-Ванген и др. 2018. су утврдили да употреба ПБС-а није погодна за прање ћелија примарне акутне мијелоидне леукемије (АМЛ) извађених из периферне крви, због чињенице да се многе ћелије изгубе лизијом, уз велико смањење материјала беланчевина.

Због тога су одредили да се примарне АМЛ ћелије не смију опрати ПБС-ом након складиштења у течном азоту.

Референце

1. Цолл Ј. (1993). Дијагностичке технике у вирологији. Ед Диаз де Сантос. 360 пг
2. Родригуез М, Ортиз Т. ћелијска култура. Промена медијума. Одељење за нормалну и патолошку цитологију и хистологију Универзитета у Севиљи. Доступно на персонал.ус.ес
3. Припрема физиолошког пуферованог фосфата (ПБС). (2008). Стандардни оперативни поступци (СОП) Лабораторија за хуману и вирусну геномику УАСЛП Медицинска школа. Доступно на: геномица.уаслп.мк
4. "Физиолошка отопина фосфата." Википедија, Слободна енциклопедија. 3 април 2019, 19:36 УТЦ 13 април 2019, 02:57 ен.википедиа.орг.
5. Пиетрасанта Л, Вон-Билдерлинг Ц. Теме из молекуларне биофизике. Доступно на: усерс.дф.уба.ар
6. Редиар. Упутство. ПБС + ЕДТА. Доступно на: фелсан.цом.ар
7. Мартин НЦ, Пирие АА, Форд ЛВ, Цаллагхан ЦЛ, МцТурк К, Луци Д, Сцримгер ДГ. Употреба физиотерапиране пуне фосфата за опоравак ћелија и сперматозоида из бриса. Сци Јустице. 2006; 46 (3): 179-84. Доступно на: нцби.нлм.них.гов
8. Ванген Р, Аасебø Е, Трентани А и др. Начин очувања и испирање физиолошким отопинама пунираним фосфатима утичу на акутни мијелоидни леукемијски протеом. Инт Ј Мол Сци. 2018; 19 (1): 296. Доступно на: нцби.нлм.них.гов
9. Мартинез Р, Грагера Р. (2008). Теоријска и практична основа хистохемије. Врховни савет научних истрага. Мадрид. Доступно на: боокс.гоогле.цо.ве